循環(huán)腫瘤細(xì)胞的分離與鑒定研究進(jìn)展*

張 偎 綜述，徐克前 審校

1.中南大學(xué)湘雅醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)系，湖南長(zhǎng)沙 410013；2.中南大學(xué)湘雅三醫(yī)院檢驗(yàn)科，湖南長(zhǎng)沙 410013

高效分離和準(zhǔn)確鑒定循環(huán)腫瘤細(xì)胞(CTC)對(duì)腫瘤的早期診斷具有重要意義。目前，CTC的分離方法按原理可以分為物理分離和免疫分離兩大類(lèi)，且各自分為許多亞類(lèi)。分離后的細(xì)胞通常需要進(jìn)一步鑒定分析，這是因?yàn)閱渭円揽糠蛛x方法捕獲的細(xì)胞純度較低，混雜了許多白細(xì)胞。通過(guò)對(duì)細(xì)胞表面分子標(biāo)記、內(nèi)部核酸等進(jìn)行定性、定量分析，不僅能夠得到高純度的CTC，還可以根據(jù)細(xì)胞分型的結(jié)果鑒別不同來(lái)源的腫瘤，為腫瘤的轉(zhuǎn)移、用藥和監(jiān)測(cè)提供可靠的幫助。現(xiàn)對(duì)CTC的分離和鑒定方法進(jìn)行綜述。

1 CTC的分離

1.1物理分離方法 物理分離方法也稱(chēng)為“無(wú)標(biāo)簽分離”，目前主要有密度梯度離心法、基于細(xì)胞大小分離法，以及與電學(xué)、聲學(xué)、光學(xué)分離相結(jié)合的微流控技術(shù)。

1.1.1密度梯度離心法 CTC核質(zhì)比較高，根據(jù)沉降系數(shù)的差異可將CTC分離開(kāi)。目前開(kāi)發(fā)出的平臺(tái)主要有Ficoll-Hypaque、Percoll和OncoQuick。Ficoll-Hypaque分離范圍較窄，多用于分離外周血單個(gè)核細(xì)胞，而Percoll利用不同濃度的離心劑，大大拓寬了分離范圍。帶有多孔篩的OncoQuick有效減少了白細(xì)胞污染[1]。密度梯度離心法操作簡(jiǎn)單、成本低，但分離純度低，一般作為預(yù)富集方法。

1.1.2基于細(xì)胞大小分離法 CTC與血細(xì)胞相比體積通常較大，根據(jù)此差異可分離細(xì)胞。ISET、ScreenCell、Parylene-C、FMSA、CellSieve、3D鈀濾光片、鎳微孔篩等平臺(tái)均為微孔過(guò)濾裝置，平臺(tái)間的差異主要體現(xiàn)在濾膜材料、孔徑大小上，各類(lèi)微孔濾膜的比較見(jiàn)表1。這些平臺(tái)分離出的細(xì)胞可以幫助監(jiān)測(cè)疾病的進(jìn)展。如通過(guò)CellSieve微濾器分離結(jié)直腸癌切除術(shù)后患者肺靜脈血液中的CTC，可及早發(fā)現(xiàn)結(jié)直腸癌的肺部轉(zhuǎn)移[2]；通過(guò)分析CellSieve膜上捕獲的細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)循環(huán)癌基質(zhì)細(xì)胞和CTC的區(qū)別及兩者與腫瘤進(jìn)展的相關(guān)性[3]。微孔濾膜法捕獲效率高，但體積較小,有變形性的CTC可能被漏檢。

新發(fā)展的鐵流體動(dòng)力學(xué)細(xì)胞分離(FCS)并不像大多數(shù)傳統(tǒng)方法一樣在膜上進(jìn)行，而是利用生物相容性的鐵磁流體，對(duì)不同大小的細(xì)胞進(jìn)行分離[4]。在癌細(xì)胞加標(biāo)率約為每毫升100個(gè)的情況下，對(duì)肺癌、乳腺癌、前列腺癌來(lái)源的多種癌細(xì)胞系進(jìn)行富集分離，平均捕獲率達(dá)92.9%[5]。FCS具有較高的生物相容性，細(xì)胞活力不受影響，但該方法仍無(wú)法從癌癥患者的血液中富集低濃度的CTC。

表1 各類(lèi)微孔濾膜的比較

1.1.3微流控技術(shù) 微流控技術(shù)利用細(xì)胞慣性差異來(lái)分離細(xì)胞，不同質(zhì)量的細(xì)胞在流動(dòng)過(guò)程中產(chǎn)生不同的方向和速度。質(zhì)量較大的CTC主要受慣性升力作用向內(nèi)壁移動(dòng)，而質(zhì)量較小的血細(xì)胞主要受迪安流影響向外壁遷移。為提高分離效果，通道可設(shè)計(jì)成不同的形狀。如Vortex通道設(shè)計(jì)為直線(xiàn)形，ClearCell FX通道設(shè)計(jì)為對(duì)細(xì)胞活性更友好的螺旋形，而CTC-ΔChip平臺(tái)采用出口逐漸加寬的楔形設(shè)計(jì)，有效解決了出口堵塞問(wèn)題。EDD 等[6]還報(bào)道了一種可用于分離CTC簇的微流體通道，該裝置以30 mL/h的速度將CTC簇捕獲在載玻片大小的裝置上。

微流控技術(shù)近幾年來(lái)發(fā)展迅速的一個(gè)重要原因是它可以與許多分離方法聯(lián)合使用，如電場(chǎng)分離、聲場(chǎng)分離、光學(xué)分離，在實(shí)現(xiàn)快速分離的同時(shí)有效保留細(xì)胞生物活性。ApoStream和LIFF是與電場(chǎng)分離相結(jié)合的微流控裝置，細(xì)胞介電特性的差異使CTC向帶有電極的方向移動(dòng)，而血細(xì)胞被排斥流向洗脫液[7]。LIFF在原有的基礎(chǔ)上增加了電極數(shù)目，提高了分離速度[8]。Acoustic Chip是與聲學(xué)分離相結(jié)合的微流體裝置，產(chǎn)生駐波的壓電轉(zhuǎn)換器是設(shè)備的關(guān)鍵組件，不同體積和密度的細(xì)胞在聲場(chǎng)中產(chǎn)生不同的壓力節(jié)點(diǎn)而被分離[9]。光學(xué)分離根據(jù)折射率差異提示細(xì)胞間的差異，如流式細(xì)胞儀的前向散射光可反映細(xì)胞體積大小，側(cè)向散射光可反映細(xì)胞內(nèi)容物、核含量等信息，但該方法分離的細(xì)胞群常有交叉，需要質(zhì)控和定期校正。

1.2免疫分離方法 免疫分離方法主要通過(guò)抗原抗體、適配體等免疫相關(guān)物質(zhì)之間的特異性結(jié)合達(dá)到分離的目的。

1.2.1磁場(chǎng)中分離 在磁性載體上包被特異性抗體或適配體，利用外加磁場(chǎng)的作用分離細(xì)胞，根據(jù)載體靶向細(xì)胞的不同，可分為正向和負(fù)向兩種富集策略。

基于正向富集建立的平臺(tái)有Cellsearch、MACs等，其中Cellsearch已被廣泛應(yīng)用。但腫瘤在轉(zhuǎn)移過(guò)程中容易發(fā)生上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化，導(dǎo)致上皮細(xì)胞黏附因子(EpCAM)低表達(dá)甚至不表達(dá)，因此，其他分子標(biāo)記也正被逐步應(yīng)用到CTC的分離中。如在磁納米粒子上包被脂質(zhì)體和衍生物[10]及EpCAM和N-鈣黏附蛋白[11]或表皮生長(zhǎng)因子受體(EGFR)[12]的雙抗體，有效提高了不同腫瘤CTC的捕獲效率。

正向富集法的另一個(gè)缺點(diǎn)在于分離過(guò)程中可能丟失分子標(biāo)記，不利于后續(xù)鑒定分析和細(xì)胞培養(yǎng)，此時(shí)，負(fù)向富集法的優(yōu)勢(shì)得以顯現(xiàn)。負(fù)向富集法建立的平臺(tái)有Cyttel、EasySep、MagSweeper等。其中，Cyttel、EasySep以磁珠為載體，MagSweeper利用磁性棒作為載體以減少非特異吸附。雖然負(fù)向富集法可以有效解決漏檢的問(wèn)題，但捕獲純度有待提高。

1.2.2流動(dòng)相分離 流動(dòng)相分離CTC可分別在體外和體內(nèi)進(jìn)行。CTC的體外分離主要是通過(guò)微流控芯片來(lái)實(shí)現(xiàn)，捕獲的細(xì)胞可直接在芯片內(nèi)計(jì)數(shù)與鑒定，也可以通過(guò)洗脫收集細(xì)胞。出現(xiàn)早且應(yīng)用廣的平臺(tái)有CTC-Chip、HB-Chip、CTC-iChip和Nanovelcro芯片等。CTC-Chip易造成樣品堵塞；HB-Chip由于采用了透明材料，可用于高分辨率成像；由兩個(gè)模塊構(gòu)成的CTC-iChip有較高的捕獲純度效率；Nanovelcro芯片以納米纖維為捕獲基質(zhì)，極大提高了捕獲效率。有報(bào)道利用激光顯微切割系統(tǒng)分離Nanovelcro芯片捕獲的單個(gè)CTC，發(fā)現(xiàn)肺腺癌與間變性淋巴瘤激酶(ALK)基因重排[13]和EGFR突變[14]有較強(qiáng)的相關(guān)性，可以有效監(jiān)測(cè)疾病進(jìn)展和耐藥反應(yīng)。

最近也出現(xiàn)了一些新的微流控檢測(cè)平臺(tái)，這里報(bào)道一種二維分選裝置，它對(duì)細(xì)胞表面標(biāo)志物進(jìn)行兩次分型，從而精細(xì)化地將細(xì)胞分選為不同亞群，可以有效評(píng)估腫瘤的轉(zhuǎn)移、惡化[15]。由于分離過(guò)程中的血細(xì)胞干擾是較大的影響因素，LI等[16]制造了紅細(xì)胞膜模擬表面的捕獲基質(zhì)以吸附血細(xì)胞，并利用靶向配體的連接實(shí)現(xiàn)Hela細(xì)胞的高捕獲率(91%)和高純度(89%)。

高科技的發(fā)展也推動(dòng)了體內(nèi)分離技術(shù)的進(jìn)步，但目前出現(xiàn)的裝置并不多，主要是CellCollector和微型電機(jī)。CellCollector是涂覆有EpCAM抗體的醫(yī)用不銹鋼絲，將鋼絲置于靜脈血管內(nèi)30 min即可捕獲CTC[17]。微型電機(jī)以腫瘤患者體內(nèi)的H2O2作為推進(jìn)能源，電機(jī)表面涂覆抗體快速定位靶細(xì)胞[18]。體內(nèi)富集方法無(wú)需采血，保證了充足的樣本來(lái)源，但影響因素多，如存在高脂血癥、黃疸等導(dǎo)致的非特異吸附問(wèn)題，其安全性也還需進(jìn)一步驗(yàn)證。

2 CTC的鑒定

目前，鑒定CTC的方法主要有免疫熒光染色法、核酸分析法、光譜分析法及蛋白質(zhì)分析法。

2.1免疫熒光染色法 免疫熒光染色法利用熒光素標(biāo)記對(duì)細(xì)胞進(jìn)行鑒定，常用的細(xì)胞標(biāo)記有核染色(DAPI、Hoechst)、上皮細(xì)胞表面抗原(CKs)、間充質(zhì)蛋白和白細(xì)胞分化抗原(CD)等。許多新的標(biāo)志物也不斷被學(xué)者應(yīng)用到腫瘤的研究中，以往的研究發(fā)現(xiàn)高表達(dá)CD44、CD47的腫瘤細(xì)胞有更強(qiáng)的遷移和侵襲能力，這些細(xì)胞標(biāo)志物可以幫助患者選擇用藥以提供精準(zhǔn)的治療方案，如GUIBERT等[19]檢測(cè)非小細(xì)胞肺癌患者腫瘤組織和細(xì)胞的程序性死亡蛋白配體-1(PD-L1)水平，以篩選可用于免疫檢查點(diǎn)抑制劑治療的患者，熒光顯微鏡、自動(dòng)化圖像識(shí)別設(shè)備和多參數(shù)的流式細(xì)胞分選系統(tǒng)可以用來(lái)觀(guān)測(cè)熒光染色結(jié)果。熒光顯微鏡適用于樣本量較小的研究，CellSearch即是通過(guò)此種方法鑒定CTC，但存在人工鏡檢造成的主觀(guān)偏倚。自動(dòng)化圖像識(shí)別設(shè)備克服了上述缺點(diǎn)，捕獲的細(xì)胞經(jīng)光纖陣列掃描后，傳感器將圖像呈遞給軟件進(jìn)行處理，常應(yīng)用于芯片、膜等固體化捕獲裝置的成像分析，但該方法要求固相載體保持一定清潔度，且細(xì)胞為單層排列。多參數(shù)流式細(xì)胞分選系統(tǒng)使用多種細(xì)胞表面標(biāo)記，在鑒定細(xì)胞表型的同時(shí)可以高效分選細(xì)胞，SEN等[20]利用流式分選系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)了多種腫瘤細(xì)胞系的分離。

2.2核酸分析法 檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)部核酸的核酸分析法主要以分子雜交、PCR和基因測(cè)序?yàn)榇怼?/p>

分子雜交法利用生物探針與細(xì)胞核酸雜交可對(duì)細(xì)胞定性、定位。Canpatrol通過(guò)與捕獲細(xì)胞的mRNA分子雜交，檢測(cè)準(zhǔn)確度達(dá)80%。最近報(bào)道的一種TPN生物探針，能夠滲透進(jìn)入活細(xì)胞與線(xiàn)粒體特異結(jié)合，根據(jù)線(xiàn)粒體的發(fā)光差異來(lái)區(qū)分腫瘤細(xì)胞和血細(xì)胞[21]。這種探針對(duì)細(xì)胞活力和完整性影響很小，可以作為鑒定CTC的新工具。

OncoCEE和AdnaTest應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)，通過(guò)檢測(cè)多種乳腺癌相關(guān)基因來(lái)評(píng)估轉(zhuǎn)移性乳腺癌的發(fā)生與發(fā)展。除了鑒定細(xì)胞系別，PCR技術(shù)還可以用于建立腫瘤模型。有研究表明，從不同細(xì)胞系中分離出的EpCAM(+)和HER2(+)亞群用于建立更接近原位的3D乳腺癌腫瘤模型，可以更準(zhǔn)確地評(píng)估新的治療策略和藥物[22]。ZHAO等[23]通過(guò)PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)CTC-3細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化和干性標(biāo)志物的水平較MCF-7細(xì)胞更高，提示CTC-3細(xì)胞是研究乳腺癌惡性行為的更好模型。近年來(lái)，液滴/微孔PCR發(fā)展迅速，并可對(duì)多種遺傳信息如CRISPR/Cas9改進(jìn)的KRAS突變、乳腺癌PIK3CA熱點(diǎn)突變進(jìn)行快速、可靠、準(zhǔn)確的定量檢測(cè)，該技術(shù)有廣闊的發(fā)展前景，未來(lái)有望逐步取代傳統(tǒng)的PCR。

基因測(cè)序目前應(yīng)用最廣泛的是單細(xì)胞測(cè)序。XU等[24]對(duì)早期肺癌患者外周血中單個(gè)CTC進(jìn)行外顯子DNA測(cè)序，檢測(cè)到包括細(xì)胞侵襲、DNA修復(fù)等相關(guān)基因的突變，有利于進(jìn)一步探索腫瘤的異質(zhì)性信息。單細(xì)胞測(cè)序還能通過(guò)拷貝數(shù)變異檢測(cè)存在異常的基因組，通過(guò)在數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行比對(duì)，從而在分子水平上分析單個(gè)細(xì)胞。

核酸分析法的關(guān)鍵在于檢測(cè)的基因與所研究疾病要有較強(qiáng)的關(guān)聯(lián)程度，與免疫熒光法相比，它可以提供客觀(guān)、可量化的結(jié)果，但需要裂解細(xì)胞，難以提供形態(tài)學(xué)方面的數(shù)據(jù)。

2.3光譜分析法 光譜分析技術(shù)廣泛應(yīng)用于生物化學(xué)領(lǐng)域，如今也有用于鑒定CTC的報(bào)道，主要是微核磁共振檢測(cè)技術(shù)和拉曼檢測(cè)技術(shù)。

與磁場(chǎng)分離有異曲同工之處，微核磁共振檢測(cè)系統(tǒng)中包被抗體的磁納米顆粒與細(xì)胞結(jié)合后經(jīng)磁響應(yīng)而被分離，但后者產(chǎn)生的核磁共振信號(hào)起到了微小放大的作用，有效提高了檢測(cè)靈敏度,研究表明對(duì)大腸癌有較好的診斷價(jià)值[25]。拉曼檢測(cè)技術(shù)利用包被特異性抗體的活性納米探針與細(xì)胞結(jié)合，根據(jù)不同類(lèi)型細(xì)胞特征譜線(xiàn)的差異鑒定CTC，這些納米探針由不同的拉曼報(bào)告分子(主要是有機(jī)化學(xué)物質(zhì))和納米顆粒構(gòu)成，如CHO等[26]利用金納米顆粒構(gòu)成的活性探針鑒定出了乳腺癌的5種亞型。拉曼檢測(cè)技術(shù)還可以無(wú)損傷地對(duì)細(xì)胞內(nèi)部核酸進(jìn)行分析，具有高靈敏度、高分辨率的特點(diǎn)，但目前主要用于檢測(cè)循環(huán)游離DNA和DNA損傷修復(fù)，相信未來(lái)在CTC鑒定方面有進(jìn)一步的發(fā)展。

2.4蛋白質(zhì)分析法 蛋白質(zhì)分析法在基因翻譯水平通過(guò)檢測(cè)蛋白質(zhì)水平來(lái)鑒定CTC，電泳技術(shù)、Northern雜交是常見(jiàn)的檢測(cè)手段，這里介紹的蛋白質(zhì)芯片/微陣列即是基于以上技術(shù)原理而開(kāi)發(fā)的。ProteinSimple公司研發(fā)的Milo是第一個(gè)可用于CTC鑒定的蛋白質(zhì)芯片，由1 000～2 000個(gè)用于容納單細(xì)胞的微孔構(gòu)成，細(xì)胞被裂解后電泳，并加入多種熒光抗體標(biāo)記同時(shí)檢測(cè)數(shù)十種靶蛋白，與傳統(tǒng)檢測(cè)方法相比，可以進(jìn)行單個(gè)細(xì)胞水平的鑒定分析。除此之外，通過(guò)檢測(cè)一系列代謝基因編碼的蛋白質(zhì)，蛋白質(zhì)分析法可以發(fā)現(xiàn)CTC高表達(dá)的基因，探索腫瘤與代謝基因的關(guān)系，并提示腫瘤的惡性變化。CHEN等[27]利用蛋白微陣列檢測(cè)前列腺癌患者的腫瘤細(xì)胞，確定磷酸甘油酸激酶(PGK1)和葡萄糖六磷酸脫氫酶(G6PD)可以作為CTC的最佳代謝標(biāo)志物，且患者體內(nèi)PGK1和G6PD水平與前列腺癌轉(zhuǎn)移程度呈正相關(guān)。但由于不同核酸的基因表達(dá)產(chǎn)物可能相似或一致，檢測(cè)靶蛋白前，需要確定涉及的相關(guān)基因的表達(dá)產(chǎn)物是否有交叉，否則無(wú)法得到真實(shí)可靠的結(jié)論。目前已經(jīng)發(fā)展起來(lái)的CTC鑒定方法見(jiàn)表2。

表2 CTC的鑒定方法

3 總結(jié)與展望

美國(guó)食品藥品管理局(FDA)將CTC正式批準(zhǔn)為癌癥進(jìn)展監(jiān)測(cè)中新的生物標(biāo)志物，它的分離、鑒定對(duì)于腫瘤早期診斷、病情監(jiān)測(cè)十分重要，因此，發(fā)展了許多技術(shù)方法。物理分離方法無(wú)需抗體標(biāo)記或染色，可以較好地保留細(xì)胞的完整性和生物學(xué)活性，有利于后續(xù)細(xì)胞培養(yǎng)；而免疫學(xué)分離方法可能造成細(xì)胞抗原的丟失、改變。這些分離富集的方法推動(dòng)了腫瘤疾病中整個(gè)基因組的研究，因此，需要通過(guò)各種分子標(biāo)記、核酸分析、光譜分析等方法對(duì)細(xì)胞分離、鑒定。目前，檢測(cè)CTC仍處于臨床前階段，限制其臨床應(yīng)用的主要因素是缺乏可靠的臨界值，以及用于分離、鑒定CTC的工具尚未成熟，還需要進(jìn)行大量的臨床試驗(yàn)來(lái)提供有效的證據(jù)。未來(lái)，相信CTC的檢測(cè)平臺(tái)會(huì)向著分離、鑒定一體化、多種技術(shù)聯(lián)合應(yīng)用的方向發(fā)展，并能夠以簡(jiǎn)便快速、準(zhǔn)確可靠、低成本、高通量的檢測(cè)優(yōu)勢(shì)服務(wù)于臨床與科研。