血流感染中頭孢吡肟異質性耐藥大腸埃希菌的流行病學分析*

吳 瑕，何建春，趙峻英，馮 婭

重慶市大足區人民醫院檢驗科，重慶 402360

大腸埃希菌是一種常見的條件致病菌，在某些條件下容易引起血流感染，最終導致膿毒癥或其他并發癥，嚴重威脅患者生命安全[1]。然而，近年來由于臨床不合理用藥或經驗用藥導致高比例耐第3代頭孢菌素菌株不斷增加，甚至出現了一定比例耐頭孢吡肟菌株[2]，給臨床抗感染治療帶來極大困擾。筆者團隊在進行K-B法復核頭孢吡肟藥敏時，發現其抑菌圈內有大小不等的菌落生長，通過文獻得知其為異質性耐藥[3]，并且異質性耐藥菌株通常是細菌從敏感進化到耐藥過程的中間階段菌株，如果不通過常規的K-B法，很難發現該類型的菌株[4]。因此，該類型的菌株將比敏感菌株更快進化成耐藥菌株。本研究對頭孢菌素類抗菌藥物產生異質性耐藥的大腸埃希菌進行研究，并通過雙病例對照研究調查分析本院2015年1月至2018年12月血流感染中異質性耐藥大腸埃希菌的流行病學情況，為指導臨床合理用藥從而預防和控制該類菌株甚至耐藥菌株的出現提供依據。

1 資料與方法

1.1一般資料 回顧性收集本院2015年1月至2018年12月血流感染中分離的248株大腸埃希菌，去除同一患者反復培養陽性的重復菌株。根據大腸埃希菌對頭孢吡肟藥敏情況分為頭孢吡肟耐藥組、頭孢吡肟異質性耐藥組、頭孢吡肟敏感組。

1.2方法

1.2.1菌株鑒定、藥敏情況及超廣譜β-內酰胺酶(ESBLs)確證 所選標本均為血液標本，并依據《全國臨床檢驗操作規程》第4版[5]進行細菌的分離和培養，然后采用Vitek 2 Compact全自動細菌鑒定系統進行細菌鑒定，采用其配套藥敏卡分析細菌對各類抗菌藥物的最小抑菌濃度(MIC)，即藥敏試驗。最后，依據美國臨床實驗室標準化委員會(CLSI)標準判讀結果。ESBLs檢測及確證：依據CLSI，采用雙紙片協同試驗進行確證。

1.2.2K-B法 在血平板上復蘇248株大腸埃希菌，并根據《全國臨床檢驗操作規程》第4版[5]進行K-B法標準操作，貼上頭孢吡肟藥敏紙片，于35 ℃孵育24～48 h后，測量其抑菌圈直徑，若觀察到抑菌圈內有菌落生長則初步判斷為異質性耐藥。相反，則為敏感、中介或耐藥。

1.2.3菌落譜型分析(PAP)實驗 該實驗是判定異質性耐藥現象的“金標準”[3]。異質性耐藥判斷標準：細菌在抗菌藥物最高非抑菌濃度到最低完全抑菌濃度之間的比值≥8倍[3]。將K-B法初篩為異質性耐藥的菌株進一步通過PAP實驗進行確證，PAP實驗步驟參考文獻[6]，主要步驟為：配制梯度頭孢吡肟抗菌藥物，制備梯度頭孢吡肟抗菌藥物平板，細菌均勻涂布頭孢吡肟抗菌藥物平板并孵育，每次實驗重復3次再計數，并進行換算和作圖。將大腸埃希菌標準菌株ATCC25922作為質控菌株。

1.2.4脈沖場凝膠電泳(PFGE) 該方法主要用于細菌同源性分型，是判定臨床菌株間是否發生同源性暴發最重要的方法。選擇MIC相同或相近的異質性耐藥菌株共20株，通過相關文獻報道的PFGE方法完成該實驗[7]，最后再通過PFGE條帶分析這些臨床菌株間的同源性。

1.2.5相關耐藥基因的檢測 選擇頭孢吡肟異質性耐藥組的菌株為研究對象，進行相關耐藥基因檢測。首先,提取細菌的DNA，然后通過PCR法檢測其可能存在的相關耐藥基因，包括blaCTX-M、blaTEM、blaSHV、blaOmpF和blaOmpC等，其所需引物參考文獻[7]設計。

1.2.6相關危險因素分析 采用雙病例對照研究，通過本院臨床病歷系統和檢驗科醫院管理系統收集248例感染大腸埃希菌患者的相關資料，包括患者基本情況、基礎疾病、并發癥、侵入性操作、先前抗菌藥物使用和患者轉歸等。

1.3統計學處理 采用SPSS22.0軟件進行統計學分析。計數資料以率表示，采用χ2檢驗，采用多因素Logistic回歸(逐步前進法)進行因素分析，以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1菌株頭孢吡肟異質性耐藥率及臨床分布特征 在248株菌株中，K-B法復核后發現，在K-B法抑菌圈內有菌落生長的菌株共78株，并將其初步判定為異質性耐藥菌株，見圖1。然后再將這些菌株通過PAP實驗進行確認，發現其均為異質性耐藥菌株。藥敏分析結果顯示，在248株菌株中，對頭孢吡肟異質性耐藥的菌株有78株(占31.5%)，對頭孢吡肟耐藥的菌株有63株(占25.4%)，對頭孢吡肟敏感的菌株有107株(占43.1%)。從科室分布來看，頭孢吡肟異質性耐藥大腸埃希菌主要來自外科(146株，占58.9%)，主要集中在泌尿外科(38株，占26.0%)、ICU(28株，占19.2%)和感染科(18株，占12.3%)。

2.2頭孢吡肟異質性耐藥大腸埃希菌的PFGE分型 通過對比分析20株頭孢吡肟異質性耐藥大腸埃希菌的PFGE條帶，結果未發現有相同或相似PFGE條帶，表明這些菌株間型別及來源不同，不存在同源性傳播，見圖2。

2.3頭孢吡肟異質性耐藥菌株耐藥基因的檢測 通過對78株頭孢吡肟異質性耐藥大腸埃希菌的耐藥基因進行檢測，結果發現所有異質性耐藥菌株均含blaOmpF和blaOmpC。在所有異質性耐藥菌株中，有32株為產ESBLs菌株，PCR檢測結果顯示，有23株表達blaCTX-M(占71.9%)，9株表達blaTEM(占28.1%)，僅3株表達blaSHV(占9.4%)，有2株同時表達blaCTX-M和blaTEM(占6.2%)，有1株同時表達blaCTX-M和blaSHV(占3.1%)。

注：A表示對頭孢吡肟敏感；B表示對頭孢吡肟異質性耐藥；C表示對頭孢吡肟耐藥。

注：1～20為20株異質性耐藥菌株的對應編號。

2.4危險因素分析

2.4.1單因素分析 頭孢吡肟耐藥組與頭孢吡肟敏感組比較，年齡>60歲、入住ICU、尿路感染、低蛋白血癥、導尿管、頭孢菌素類和產ESBLs差異有統計學意義(P<0.05)；臨床轉歸顯示，總住院>30 d差異有統計學意義(P<0.05)。頭孢吡肟耐藥組與頭孢吡肟異質性耐藥組比較，轉院患者、尿路感染、頭孢菌素類和產ESBLs差異有統計學意義(P<0.05)。頭孢吡肟異質性耐藥組與頭孢吡肟敏感組比較，轉院患者、灌腸、頭孢菌素類和產ESBLs差異有統計學意義(P<0.05)；臨床轉歸顯示，患者病死率差異有統計學意義(P<0.05)。見表1。

2.4.2多因素分析 進一步將上述單因素分析中差異有統計學意義的變量采用多因素Logistic回歸分析結果顯示，頭孢吡肟耐藥組與頭孢吡肟敏感組比較，年齡>60歲、尿路感染、導尿管、頭孢菌素類和產ESBLs是頭孢吡肟耐藥大腸埃希菌的獨立危險因素；頭孢吡肟耐藥組與頭孢吡肟異質性耐藥組比較，尿路感染和產ESBLs是頭孢吡肟耐藥大腸埃希菌的獨立危險因素；頭孢吡肟異質性耐藥組與頭孢吡肟敏感組比較,轉院、粒細胞減少癥、灌腸和產ESBLs是頭孢吡肟異質性耐藥大腸埃希菌的獨立危險因素。見表2。

表1 頭孢吡肟敏感、耐藥和異質性耐藥大腸埃希菌的單因素分析[n(%)]

續表1 頭孢吡肟敏感、耐藥和異質性耐藥大腸埃希菌的單因素分析[n(%)]

表2 頭孢吡肟敏感、耐藥和異質性耐藥大腸埃希菌的Logistic回歸分析

3 討 論

大腸埃希菌是一種常見的條件致病菌，易引起血流感染等導致患者死亡，臨床常采用頭孢菌素等抗菌藥物進行治療，導致出現越來越多的產ESBLs大腸埃希菌，頭孢吡肟是一種常見的用于抗感染治療的β-內酰胺類抗菌藥物，也作為治療該類菌感染的一個重要選擇，但近年來呈現耐藥率逐漸增高的趨勢[8]，導致臨床有時治療效果不佳或治療失敗。本研究結果發現，血流感染患者分離出的大腸埃希菌除對頭孢吡肟耐藥外，從相當比例病情惡化的患者分離的大腸埃希菌對頭孢吡肟產生了異質性耐藥現象，臨床常誤認為對頭孢吡肟敏感，而導致治療失敗。

從藥敏結果來看，本院大腸埃希菌對頭孢吡肟的耐藥率為25.4%，略低于2018年中國細菌耐藥監測網(CHINET)的監測數據[9],CHINET顯示，大腸埃希菌對頭孢吡肟的耐藥率為27.3%，但也低于本院大腸埃希菌對頭孢吡肟的異質性耐藥率(31.5%)，說明頭孢吡肟異質性耐藥現象存在且需要臨床特別注意，以防臨床治療失敗而無法找出其中的原因。從科室分布來看，頭孢吡肟異質性耐藥大腸埃希菌主要來自外科，并以泌尿外科和ICU檢出率最高，可能原因為泌尿外科患者經常進行尿路插管等操作損傷尿道而引起細菌上行感染入血，ICU患者常有非常嚴重的病情，加上各類抗菌藥物的不合理使用，使得敏感菌被殺滅而未被殺死的耐藥亞群菌引起血流感染，所以應加強對這些科室耐藥菌株的監測和防控[10]。從頭孢吡肟異質性耐藥菌株同源性來看，異質性耐藥菌株PFGE條帶不一，說明頭孢吡肟異質性耐藥菌株不是由于菌株間同源性傳播引起的。從耐藥基因檢測結果來看，異質性耐藥菌株主要表達blaCTX-M基因，與相關報道CTX-M型是目前我國最主要產ESBLs基因型結果相一致[11]，其次為TEM基因型。

進一步通過雙病例對照研究進行相關危險因素分析，結果顯示，在頭孢吡肟耐藥組、頭孢吡肟異質性耐藥組和頭孢吡肟敏感組兩兩比較中，既存在各自不同的獨立危險因素，也存在其共同的獨立危險因素。首先，分析上述兩兩比較中的各自不同的獨立危險因素，從頭孢吡肟耐藥組與頭孢吡肟敏感組比較來看，尿路感染和導尿管是頭孢吡肟耐藥大腸埃希菌的獨立危險因素。尿路感染最常見的是大腸埃希菌感染，加上人為通過侵入性操作如導尿管入侵泌尿道引起尿路感染的細菌定居和繁殖，當抗菌藥物作用于敏感細菌，而這些菌株隱蔽于導尿管等位置躲過抗菌藥物的作用或劑量不足，使得敏感菌株逐步變成耐藥菌株，再加上住院患者本來免疫力低下，使得引起尿路感染的細菌特別是耐藥菌就有機會入血液而引起耐藥菌血流感染，導致治療失敗[12]。這也與本研究發現的耐藥菌株主要來自泌尿外科相一致。另外，頭孢菌素類抗菌藥物的使用也是頭孢吡肟耐藥大腸埃希菌的獨立危險因素，并且在頭孢吡肟耐藥組有更高的頭孢菌素類抗菌藥物使用比例(46.0%vs. 16.8%)，說明頭孢菌素類抗菌藥物常用于臨床抗感染治療。長期高頻率使用該類抗菌藥物使得細菌在抗菌藥物的壓力下為了生存而發生基因突變，或產生耐藥基因，導致細菌耐藥特性發生變化，甚至導致患者體內菌群失調，使臨床治療更加棘手[13]。臨床轉歸顯示，患者病死率比較差異無統計學意義，說明患者發生頭孢吡肟耐藥后，臨床可能直接使用碳青霉烯類抗菌藥物，使得患者病情好轉。從頭孢吡肟耐藥組與頭孢吡肟異質性耐藥組比較來看，尿路感染是頭孢吡肟耐藥大腸埃希菌的獨立危險因素。異質性耐藥常直接被臨床或微生物工作者作為敏感菌株處理，因而其發生原因可能與上述一致。從頭孢吡肟異質性耐藥組與頭孢吡肟敏感組比較來看，轉院是頭孢吡肟異質性耐藥大腸埃希菌的獨立危險因素，其發生原因可能為很多患者在轉入本院前在其他更低一級醫院進行了相關不合理的治療，如濫用抗菌藥物或使用的抗菌藥物不對、不足等，導致異質性耐藥菌株的出現，在轉入本院時已經攜帶。另外，灌腸也是頭孢吡肟異質性耐藥大腸埃希菌的獨立危險因素，其原因可能是住院患者長期使用抗菌藥物，一部分抗菌藥物進入腸道逐步作用于大腸埃希菌，使得敏感大腸埃希菌在劑量不足的抗菌藥物壓力下變成異質性耐藥菌株，當患者進行灌腸時，患者腸道黏膜受損，異質性耐藥菌株乘機入血[14]。臨床轉歸顯示，患者病死率比較差異有統計學意義，異質性耐藥菌株常常被誤認為是敏感菌株，未引起臨床注意，導致治療失敗。因此，通過常規的K-B法進行異質性耐藥的篩選顯得格外重要。

最后，分析上述兩兩比較中的共同獨立危險因素，結果顯示，產ESBLs是頭孢吡肟耐藥和異質性耐藥大腸埃希菌的共同獨立危險因素，其可能原因為頭孢吡肟是一種β-內酰胺類抗菌藥物，ESBLs又是一種能夠水解β-內酰胺類抗菌藥物最常見的酶，故而產ESBLs也是一種天然的耐頭孢菌素類抗菌藥物酶，因此，應加強對ESBLs的監測，對產ESBLs菌株的治療可以選擇其他種類抗菌藥物或活性更高的碳青霉烯類抗菌藥物進行治療，以減少異質性耐藥菌的出現。

綜上所述，本院頭孢吡肟異質性耐藥大腸埃希菌比例較高，隨著臨床抗菌藥物(特別是頭孢菌素類)的不合理應用，產ESBLs菌株的不斷出現，加上臨床對異質性耐藥的關注度不夠，使得頭孢吡肟的異質性耐藥和耐藥率逐年升高，給臨床治療帶來了困難。因此，臨床可以根據患者流行病學危險因素并結合患者的病情，采取適當的防治措施，以減少頭孢吡肟耐藥和異質性耐藥大腸埃希菌的流行。本研究的不足之處在于未對異質性耐藥的發生機制進行深入研究。