黃連中藥根堿分別聯合阿米卡星與頭孢哌酮/舒巴坦對泛耐藥鮑曼不動桿菌的體外抑菌作用*

李 瑩，施 瑜，段秀杰，周銀霞

1.鎮江市中西醫結合醫院檢驗科，江蘇鎮江 212001；2.江蘇大學附屬醫院檢驗科，江蘇鎮江 212031；3.鎮江市中西醫結合醫院藥械科，江蘇鎮江 212001

近年來，因廣譜抗菌藥物的大量使用，耐多藥的鮑曼不動桿菌菌株不斷出現，且有在全球范圍內流行的趨勢，廣泛耐藥株的檢出率也逐漸升高[1-2]。臨床醫生越來越多地依賴碳青霉烯類藥物針對耐藥革蘭陰性桿菌引起的感染進行靶向治療，但耐藥革蘭陰性桿菌對碳青霉烯的耐藥率正在增加，特別是克雷伯菌和鮑曼不動桿菌[3-5]。目前，泛耐藥鮑曼不動桿菌是引起院內肺炎的主要病原體之一，可導致菌血癥和敗血癥等并發癥[6]。能治療泛耐藥鮑曼不動桿菌感染的抗菌藥物數量有限，僅包括多黏菌素和替加環素。然而，多黏菌素的功效受腎毒性和耐黏菌素的菌株限制，此外，替加環素的臨床療效仍存在爭議。因此，臨床上對泛耐藥鮑曼不動桿菌感染常采用兩藥、三藥聯合治療[7-8]。黃連中藥根堿為中藥制劑，具有辛涼解表、清熱解毒、抗菌等作用，而阿米卡星和頭孢哌酮/舒巴坦均為臨床治療鮑曼不動桿菌常用抗菌藥物[9-10]。本研究擬探討黃連中藥根堿分別聯合阿米卡星、頭孢哌酮/舒巴坦2種不同抗菌藥物的抑菌作用，為臨床合理用藥及中西藥聯合抑菌機制提供科學依據。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1標本來源 標本來自2018年9月至2019年9月鎮江市中西醫結合醫院及江蘇大學附屬醫院分離的25株鮑曼不動桿菌，質控菌為大腸埃希菌ATCC25922。

1.1.2儀器與試劑 M-H瓊脂培養基、M-H肉湯培養基、麥康凱選擇平板、血平板(上?？片敿挝⑸锛夹g有限公司，批號分別為SH103567、SH113529、HK1005、HK1010)；微生物鑒定藥敏板(珠海迪爾生物工程有限公司，批號108839)；DL-96Ⅱ型半自動微生物鑒定及藥敏分析儀、SCAN-10型自動加樣儀、DL-ZD3型數字式濁度計(珠海迪爾生物工程有限公司)；HR40-ⅡA2型生物安全柜(青島海爾特種電器有限公司)；賽默飛3111型二氧化碳培養箱(美國賽默飛科技公司)；BSA224S-CW型電子天平(德國賽多利斯公司)。

1.1.3試驗藥物 黃連中藥根堿(黃連提取物包括14.45%的鹽酸藥根堿和60.24%的鹽酸小檗堿。哈藥集團中藥二廠，批號20190716)；鹽酸藥根堿對照品、鹽酸小檗堿對照品(批號0756-201504、110317-201208，均購自中國藥品生物制品檢定所)；硫酸阿米卡星注射液(遼寧新高制藥有限公司，國藥準字H21024269，規格2 mL∶0.2 g，批號20190811)；注射用頭孢哌酮鈉/舒巴坦鈉(2∶1,珠海金鴻藥業股份有限公司，國藥準字H20066374，規格1 g，包括頭孢哌酮0.5 g與舒巴坦0.5 g，批號190527)。

1.2方法

1.2.1分離與鑒定

1.2.1.1分離培養 痰液標本以平板劃線法接種于麥康凱選擇培養基和血瓊脂培養基做分離培養，35 ℃培養18～24 h后觀察菌落形態，鮑曼不動桿菌的菌落光滑、邊緣整齊，呈灰白色、圓形，直徑2～3 mm。挑取鮑曼不動桿菌可疑菌落，涂片進行革蘭染色，并再次接種于血瓊脂培養基做分離培養，35 ℃培養18～24 h。

1.2.1.2菌落鑒定 標本分純培養后，采用DL-96Ⅱ型半自動微生物鑒定儀和藥敏分析系統按照CLSIM100-S26原則進行鑒定和藥敏試驗，25株鮑曼不動桿菌均為泛耐藥鮑曼不動桿菌，該菌株對頭孢他啶、頭孢吡肟、氨芐西林、頭孢哌酮/舒巴坦、哌拉西林/他唑巴坦、氨芐西林/舒巴坦、阿米卡星、左氧氟沙星、美洛培南、亞胺培南、米諾環素、慶大霉素、妥布霉素、復方磺胺甲噁唑全部耐藥。

1.2.2試驗方法

1.2.2.1菌液制備 將臨床分離的25株泛耐藥鮑曼不動桿菌菌落接種于M-H平板，37 ℃培養過夜，次日挑取單菌落用M-H肉湯培養4～6 h，收集細菌溶于0.9%NaCl注射液并用比濁儀校正濃度至0.5麥氏單位(約1×108CFU/mL)，再用M-H肉湯稀釋10倍備用。

1.2.2.2最低抑菌濃度(MIC)測定 參照美國臨床實驗室標準化協會推薦的微量肉湯稀釋法測定黃連中藥根堿、阿米卡星及頭孢哌酮/舒巴坦的MIC。以200.00 mg/mL黃連中藥根堿、512 μg/mL頭孢哌酮/舒巴坦、1 024 μg/mL阿米卡星作為藥物原液，用M-H肉湯配制成系列濃度：黃連中藥根堿1.56～100.00 mg/mL、頭孢哌酮/舒巴坦4～256 μg/mL、阿米卡星8～512 μg/mL。將各濃度藥液加入25組試管中，除第1管外，每管加入M-H肉湯培養基1.0 mL，然后將待測菌依次加入含藥管內并混勻，每管50 μL，同時做空白和陽性對照，35 ℃培養12～18 h，觀察結果，測定25株泛耐藥鮑曼不動桿菌對黃連中藥根堿、阿米卡星、頭孢哌酮/舒巴坦的MIC。MIC范圍為抑制細菌生長所需藥物的最低濃度范圍；MIC50為使累計50%的菌株受抑的MIC值；MIC90為使累計90%的菌株受抑的MIC值。

1.2.2.3聯合抑菌試驗 以MIC的2倍作為最高濃度，依次對黃連中藥根堿、阿米卡星、頭孢哌酮/舒巴坦進行對倍稀釋，每種藥物10個稀釋濃度，按棋盤設計法分別將不同濃度的黃連中藥根堿、阿米卡星、頭孢哌酮/舒巴坦兩兩組合加入試管中，每種藥物各0.5 mL，輕微振蕩混勻，35 ℃培養12～18 h 后觀察結果。選擇最佳組合效應時2種藥物聯用時各自的MIC，以及單獨用藥時的MIC，記錄并計算分級抑菌濃度(FIC)指數。FIC指數=黃連中藥根堿聯合的MIC/單獨的MIC+阿米卡星或頭孢哌酮/舒巴坦聯合的MIC/單獨的MIC。FIC指數≤0.5為協同作用，FIC指數>0.5～1.0為相加作用，FIC指數>1.0～2.0為無關作用，FIC指數>2.0為拮抗作用。

1.3統計學處理 采用SPSS21.0統計軟件進行整理分析，計數資料以率(%)表示，組間比較采用χ2檢驗，以P<0.05表示差異有統計學意義。

2 結 果

2.1單獨及聯合用藥的MIC及范圍 黃連中藥根堿聯合頭孢哌酮/舒巴坦的MIC均明顯降低，差異有統計學意義(P<0.05)，見表1。黃連中藥根堿分別聯合阿米卡星、頭孢哌酮/舒巴坦后，其MIC范圍與3藥單獨相比保持不變或有所降低，而黃連中藥根堿聯合頭孢哌酮/舒巴坦降低最為明顯，差異有統計學意義(P<0.05)，見表2、3。

表1 25株鮑曼不動桿菌中黃連中藥根堿、阿米卡星、頭孢哌酮/舒巴坦單獨及聯合用藥的MIC

表2 黃連中藥根堿、阿米卡星單獨及聯合用藥的MIC范圍

表3 黃連中藥根堿、頭孢哌酮/舒巴坦單獨及聯合用藥的MIC范圍

2.2單獨及聯合用藥的MIC分布情況 單獨用藥時，隨著藥物濃度的升高，廣泛耐藥鮑曼不動桿菌在使用黃連中藥根堿、阿米卡星后的陽性菌株比例先升后降，使用頭孢哌酮/舒巴坦后陽性菌株比例持續升高。黃連中藥根堿與阿米卡星，黃連中藥根堿與頭孢哌酮/舒巴坦聯合用藥后，陽性菌株比例總體上隨著藥物濃度升高而降低。見表4、5。

表4 黃連中藥根堿、阿米卡星單獨及聯合用藥的MIC與陽性菌株分布

2.3相同累計抑菌率時單獨及聯合用藥濃度的藥物濃度 在累計抑菌率相同時，聯合用藥的藥物濃度較單獨用藥時低，其中黃連中藥根堿聯合頭孢哌酮/舒巴坦濃度降低最為明顯，差異有統計學意義(P<0.05)。見表6。

表5 黃連中藥根堿、頭孢哌酮/舒巴坦單獨及聯合用藥的MIC與陽性菌株分布

表6 相同累計抑菌率時黃連中藥根堿、阿米卡星、頭孢哌酮/舒巴坦單獨及聯合用藥的藥物濃度

2.4聯合用藥時不同FIC指數的占比 黃連中藥根堿聯合阿米卡星聯合用藥FIC指數為1.0～<2.0時占比為72%，以無關作用為主；黃連中藥根堿聯合頭孢哌酮/舒巴坦用藥FIC指數為0.5～<1.0時占比為72%，以相加作用為主。見表7。

表7 黃連中藥根堿分別聯合阿米卡星、頭孢哌酮/舒巴坦用藥的不同FIC指數占比[n(%)]

3 討 論

鮑曼不動桿菌耐藥現象呈逐年上升趨勢，其對β-內酰胺類、氟喹諾酮類、氨基糖苷類等抗菌藥物均有一定的耐藥性，給臨床抗菌治療帶來巨大挑戰[11-12]。對潛在抗菌藥物進行的一項關于植物源性物質的活性研究表明，天然植物的活性化合物可能成為未來新藥的來源[13]。一些從草藥中提取的活性化合物顯示出對鮑曼不動桿菌和其他革蘭陰性菌具有潛在活性。有研究報道，從草藥提取物中鑒定出的6種最活躍的化合物之一為來自黃芩的黃芩苷，幾種清熱解毒的中草藥通過不同的作用機制均具有抗炎和抗菌作用[14]。鮑曼不動桿菌感染診治與防控專家共識建議，耐藥鮑曼不動桿菌的治療主張聯合用藥[15]。有研究顯示，黃連主要含有多糖、揮發油、有機酸、甾體、萜類、黃酮、香豆素、木脂素、異喹啉類生物堿等多種化學成分，具有抗菌、消炎、抗氧化、降血糖、抗腫瘤、調血脂、抗心律失常等藥理活性，其與抗菌藥物聯合用藥已成為新的探索方向[16]。

帥麗華等[17]研究顯示，黃連提取物與左氧氟沙星聯合用藥后對大部分耐藥菌(90.9%)均表現為協同或相加作用。吳東美等[18]研究顯示，抗菌藥物、消毒劑(氯己定)和抗菌中藥(黃連)均能誘導細菌產生交叉耐藥，細菌對三者的抑菌機制可能相同。本研究結果顯示，黃連中藥根堿分別聯合阿米卡星、頭孢哌酮/舒巴坦用藥的MIC分布濃度較單獨用藥有所降低，尤其黃連中藥根堿聯合頭孢哌酮/舒巴坦用藥的MIC分布濃度較單獨用藥降低最為明顯，表明黃連中藥根堿與頭孢哌酮/舒巴坦聯合用藥效果較好。在累計抑菌率相同時，聯合用藥的藥物濃度較單獨用藥時低，其中黃連中藥根堿聯合頭孢哌酮/舒巴坦藥物濃度降低最為明顯，表明在相對較低濃度時黃連中藥根堿與頭孢哌酮/舒巴坦可以取得同等的抑菌效果，其可以減輕患者的抗菌藥物負擔。本研究結果顯示，黃連中藥根堿聯合阿米卡星用藥16%為相加作用，72%為無關作用，12%為拮抗作用，表明黃連中藥根堿與阿米卡星對泛耐藥鮑曼不動桿菌的體外聯合抑菌作用較弱。而黃連中藥根堿聯合頭孢哌酮/舒巴坦用藥24%為協同作用，72%為相加作用，4%為無關作用，表明黃連中藥根堿與頭孢哌酮/舒巴坦聯合對泛耐藥鮑曼不動桿菌的體外聯合抑菌作用較好。有研究顯示，雙黃連聯合米諾環素和哌拉西林/他唑巴坦對廣泛耐藥鮑曼不動桿菌多數表現為無關作用和拮抗作用，體外聯合抑菌作用較差；而雙黃連聯合頭孢哌酮/舒巴坦的體外抑菌作用較好[19]。研究還顯示，頭孢哌酮/舒巴坦具有明顯的抗菌活性[20]。以上研究均都與本研究結果相一致，機制可能與干擾細菌核酸、蛋白等組分合成、抑制細菌的外排泵等因素有關。

綜上所述，黃連中藥根堿聯合頭孢哌酮/舒巴坦增強了單獨用藥(頭孢哌酮/舒巴坦)的抑菌效果，通過減少頭孢哌酮/舒巴坦的用量可以延緩細菌耐藥，其體內抑菌效果及具體耐藥機制仍有待進一步深入研究。