lncRNA HCG11-201對腎癌細胞增殖和侵襲的影響*

楊 超，譚 威，崔應東，向 奎，廖兆琳

恩施土家族苗族自治州民族醫院泌尿外科，湖北恩施 445000

腎癌是泌尿系統最常見的惡性腫瘤之一，起源于腎實質泌尿小管上皮系統，其發病率在我國呈逐年增加的趨勢[1]。腎癌的主要治療手段是外科手術，對放療和化療均不敏感[2]。腎癌發病機制尚未完全闡明，其分子機制研究對治療方案的篩選和預后判斷具有非常重要的臨床價值。

長鏈非編碼RNA(lncRNA)是一類超過200核苷酸的非編碼小分子RNA，可在染色質修飾、轉錄、轉錄后等多個水平進行基因表達的調控[3]。lncRNA參與調控細胞增殖、發育、凋亡、分化、驗證等細胞活動，在細胞生理和病理過程中起關鍵作用[4]。有研究表明，lncRNA在多種惡性腫瘤如神經膠質瘤、乳腺癌、宮頸癌等中表達異常，與腫瘤細胞的惡性生物學行為密切相關[5]。HCG11-201是一種新發現的lncRNA，在前列腺癌、神經膠質瘤等腫瘤中均扮演“抑癌基因”的作用[6-7]。本研究旨在探討HCG11-201在腎癌組織和細胞系中的表達情況及對腎癌患者預后的影響，并進一步研究HCG11-201對腎癌細胞增殖和侵襲的影響。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1標本來源 選取2017年3月至 2019年7月在恩施土家族苗族自治州民族醫院泌尿外科進行腎癌手術切除的患者59例為研究對象，標本來源于患者的腎癌組織和癌旁正常組織(距離腫瘤邊緣2 cm以外)。患者平均年齡(63.21±13.86)歲；男37例，女22例；臨床分期：T1期24例，T2期21例，T3期14例。組織學分級：高、中分化腺癌27例，低分化腺癌32例。所有患者術前均未接受化療及放療，癌組織標本均經病理確診為腎癌。本研究經恩施土家族苗族自治州民族醫院倫理委員會批準，所有患者均簽署知情同意書。

1.1.2細胞與試劑 腎癌細胞(ACHN、Caki-1、786-O、A498和OS-RC-2)和人正常腎小管上皮細胞(HK-2)購自上海素爾生物科技有限公司；RPMI 1640培養基、DMEM高糖培養基和胎牛血清購自美國Hyclone公司；HCG11-201質粒和陰性對照質粒購自上海艾博斯生物技術有限公司；Lipofectamine 3000購自美國Invitrogen公司；PCR試劑盒購自寶生物(大連)公司；MTT購自美國Sigma公司；Transwell小室購自美國Corning公司；Matrigel基質膠購自美國BD公司；線粒體融合蛋白2(mitofusion-2)、p-AKT、p-mTORC2、p-IKK、p-MDM2和β-actin單克隆抗體購自Santa Cruz(北京)公司；引物購自上海生工生物工程公司。

1.2方法

1.2.1細胞培養和轉染 用含10%胎牛血清的DMEM高糖培養基培養腎小管上皮HK-2細胞，用含10%胎牛血清的RPMI 1640培養基培養腎癌細胞ACHN、Caki-1、786-O、A498和OS-RC-2，置于37 ℃、5% CO2的培養箱中培養和傳代。取對數生長期的Caki-1細胞接種于6孔板內，待細胞融合度達到50%，根據Lipofectamine 3000轉染試劑說明書進行轉染。實驗分為對照組和實驗組。對照組轉染陰性對照質粒，實驗組轉染HCG11-201質粒。轉染24 h后更換新鮮培養基。

1.2.2RNA提取和實時熒光定量PCR(qPCR)檢測 提取組織和細胞總RNA，并反轉錄成cDNA，分別采用HCG11-201、miR-522、mitofusion-2引物進行qPCR擴增，以GAPDH為內參，檢測細胞中HCG11-201和mitofusion-2的表達，以U6為內參檢測細胞中miR-522的表達。具體步驟嚴格參照說明書操作。實驗數據采用2-ΔΔCt法分析。引物序列見表1。

1.2.3MTT法 轉染完成后24 h，消化收集每組細胞，將Caki-1細胞接種至96孔板，每孔100 μL，在培養箱中培養。在第1、2、3、4、5天時間點，向每孔加入20 μL MTT試劑，在培養箱中繼續培養，觀察顏色變化。4 h后棄去上清液，每孔加入150 μL二甲基亞砜，振蕩15 min保證結晶溶解。酶標儀測量每孔在490 nm波長處的吸光度(A)值。以A值為縱軸，時間(d)為橫軸，繪制細胞生長曲線。

表1 qPCR引物序列

1.2.4Transwell小室實驗 采用RPMI 1640培養基稀釋Matrigel基質膠，在Transwell上室加入50 μL稀釋后的Matrigel基質膠，培養箱內凝固成形。Transwell下室加入600 μL含10%胎牛血清的RPMI 1640培養基。轉染完成后24 h，消化收集每組細胞，使用無血清培養基重懸后，分別接種到Transwell上室，每室5×104個細胞。24 h后棄去培養基，棉簽擦去未穿過膜的細胞。甲醇溶液固定20 min，結晶紫溶液染色20 min。顯微鏡下隨機選5個視野，計數穿透細胞數。

1.2.5生物信息學方法預測 采用GEPIA數據庫對腎癌中HCG11-201的表達進行生存分析。采用靶基因預測軟件LncBase Predicted v.2預測HCG11-201可吸附結合的微小RNA(miRNA)。采用靶基因預測軟件MicroT-CDS預測miRNA的下游基因。

1.2.6Western blot 轉染完成后48 h，消化收集每組細胞，提取總蛋白。等量上樣至10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳，冰浴下90 V轉膜至PVDF膜。5%脫脂牛奶在37 ℃封閉2 h。分別與一抗(mitofusion-2、p-AKT、p-mTORC2、p-IKK、p-MDM2和β-actin)在4 ℃下孵育過夜。洗膜后，分別與二抗在室溫下孵育1 h。洗膜后，采用凝膠成像分析儀曝光、顯影。

2 結 果

2.1HCG11-201在腎癌組織和癌旁正常組織中的表達 癌旁正常組織和腎癌組織中 HCG11-201的相對表達水平分別為8.03±0.56和3.17±0.37，差異有統計學意義(P<0.01)。

2.2HCG11-201在腎癌患者中的生存分析 GEPIA數據庫顯示，HCG11-201的相對表達水平越高，腎癌患者的生存時間越長(P<0.01)。

2.3HCG11-201在腎癌細胞和正常腎小管上皮細胞中的表達 腎癌細胞(ACHN、Caki-1、786-O、A498和OS-RC-2)和正常腎小管上皮細胞(HK-2)中 HCG11-201的相對表達水平分別為0.79±0.03、0.09±0.02、0.54±0.04、0.24±0.03、0.63±0.03和1.00±0.04，差異有統計學意義(P<0.01)，其中Caki-1細胞相對表達水平最低(P<0.01)。

2.4轉染后Caki-1細胞中HCG11-201的表達 HCG11-201質粒和陰性對照質粒轉染Caki-1細胞后抽取lncRNA，與對照組比較，實驗組細胞中HCG11-201的相對表達水平顯著升高(1.03±0.15vs.10.56±0.86)，差異有統計學意義(P<0.01)。

2.5HCG11-201對Caki-1細胞增殖活性的影響 MTT實驗結果表明，轉染HCG11-201后，從檢測第2天開始，Caki-1細胞增殖活性顯著降低(P<0.05)。見圖1。

注：與對照組比較，aP<0.05，bP<0.01。

2.6HCG11-201對Caki-1細胞侵襲能力的影響 Tranwell小室實驗結果顯示，實驗組穿過Tranwell上室基底膜的Caki-1細胞數顯著少于對照組(31.46±7.09vs.89.87±7.43)，細胞的侵襲能力顯著降低，差異有統計學意義(P<0.01)。見圖2。

注：A表示對照組，B表示實驗組。

2.7HCG11-201互補結合的miRNA及miRNA下游靶基因 靶基因預測軟件顯示，LncBase Predicted v.2預測HCG11-201互補結合的miRNA為miR-522，靶基因預測軟件MicroT-CDS預測miR-522的下游靶基因為mitofusion-2。見圖3。

2.8轉染HCG11-201對miR-522和mitofusion-2 mRNA表達的影響 qPCR顯示，與對照組比較，實驗組Caki-1細胞中miR-522的相對表達水平顯著降低(1.01±0.08vs.0.19±0.02)，差異有統計學意義(P<0.01)；mitofusion-2 mRNA的相對表達水平顯著升高(1.14±0.35vs.6.17±0.61)，差異有統計學意義(P<0.01)。

2.9轉染HCG11-201對相關蛋白表達的影響 Western blot結果顯示，轉染HCG11-201后，mitofusion-2蛋白水平升高，p-AKT、p-mTORC2、p-IKK和p-MDM2蛋白水平降低。見圖4。

圖3 HCG11-201與下游miRNA及下游靶基因的結合位點

圖4 上調HCG11-201表達后Caki-1細胞中相關蛋白的表達Western blot圖

3 討 論

腎癌的發生、發展與多種信號通路及基因的異常表達密切相關，是一個復雜的過程[8]。近年來隨著分子生物學的進展，明確腎癌的發病機制和尋找基因靶向治療是國內外研究的重點。越來越多的研究表明，lncRNA如ROR、NBAT1、AFAP1-AS1、HOTTIP等在腎癌組織和癌旁正常組織中存在差異表達，在腎癌細胞的分化、增殖、凋亡、轉移等活動中發揮重要作用[9-12]。HCG11-201是一種新發現的lncRNA，CHEN等[13]研究表明，HCG11-201在神經膠質瘤中呈低表達，可通過充當競爭性內源性RNA吸附miR-496，抑制神經膠質瘤細胞的增殖，促進細胞的凋亡。ZHANG等[7]研究表明，前列腺癌組織中HCG11-201的相對表達水平顯著低于非腫瘤組織，HCG11-201的相對表達水平與患者年齡、淋巴結轉移、前列腺特異性抗原水平、Gleason評分和腫瘤復發相關，且前列腺癌組織中HCG11-201低表達與前列腺癌患者的生存不良有關。本研究發現，HCG11-201在腎癌組織和細胞系中低表達。通過轉染上調Caki-1細胞中HCG11-201的表達，Caki-1細胞的增殖活性和侵襲能力均受到顯著抑制，表明HCG11-201的異常低表達與腎癌的發生、發展密切相關。GEPIA數據庫顯示，HCG11-201的相對表達水平越高，腎癌患者的生存時間越長，HCG11-201與腎癌患者的預后顯著相關，HCG11-201可能成為腎癌的治療靶點和預后標志物。

研究表明，lncRNA可通過充當競爭性內源性RNA吸附下游miRNA，間接抑制miRNA對下游靶基因的干擾作用[9,14]。靶基因預測軟件LncBase Predicted v.2預測HCG11-201的下游miRNA為miR-522。miR-522在骨肉瘤、結直腸癌、非小細胞肺癌等多種腫瘤中表達上調，具有促進腫瘤細胞增殖和轉移的作用，發揮顯著的“癌基因”作用[15-16]。上調HCG11-201的表達后，miR-522表達下調，表明HCG11-201可吸附miR-522，抑制miR-522的表達。靶基因預測軟件MicroT-CDS結果顯示，mitofusion-2可能是miR-522的靶基因。mitofusion-2蛋白是一種高度保守的跨膜三磷鳥苷酶，位于線粒體外膜中，是促進線粒體融合的重要成分，在維持線粒體和細胞功能方面具有重要作用[17]。mitofusion-2蛋白在多種惡性腫瘤中低表達，其過表達可顯著抑制腫瘤細胞的增殖和轉移[18]。本研究中miR-522表達被抑制后，mitofusion-2基因表達顯著增加。mitofusion-2蛋白主要通過抑制AKT/mTOR信號通路的活化，發揮腫瘤抑制作用[19]。本研究中mitofusion-2蛋白水平升高后，AKT/mTOR信號通路蛋白如p-AKT、p-mTORC2、p-MDM2和p-IKK蛋白水平均顯著降低，提示AKT/mTOR信號通路被抑制。

綜上所述，HCG11-201在腎癌組織和細胞系中低表達，HCG11-201的相對表達水平與腎癌患者的生存期具有相關性。上調腎癌細胞Caki-1中HCG11-201的表達可顯著抑制細胞的增殖和侵襲能力，其分子機制可能為HCG11-201充當競爭性內源性RNA吸附miR-522，進而促進mitofusion-2蛋白的表達。