血清miR-33a、miR-29c、miR-126聯合檢測對腦動脈粥樣硬化的診斷價值

何 麟，陳 忠，趙春勤，張浩春，鄧功建，董先成

達州市中心醫院：1.腦血管病及介入治療科；2.泌尿外科，四川達州 635000

缺血性卒中的特點是高發病率和高病死率[1]。80%的缺血性卒中是由動脈粥樣硬化造成的動脈閉塞或狹窄引起的[2]。動脈粥樣硬化是由高脂血癥伴隨的血管壁慢性炎癥所致，這種炎癥由多種細胞類型引發，如內皮細胞、平滑肌細胞和巨噬細胞[3]。微小RNA(miRNA)是內源性非編碼單鏈RNA，可通過識別位于mRNA靶標3′非翻譯區(3′UTR)的結合位點來調節基因表達，參與多種生物學功能[4-5]。血清中的miRNA常作為各種疾病的潛在生物標志物，如大腸癌、心肌梗死和急性粒細胞性白血病[6]。已有研究顯示，腦動脈粥樣硬化患者血清miR-33a、miR-29c、miR-126的表達失調[7-9]。本研究主要探討血清miR-33a、miR-29c、miR-126聯合檢測對腦動脈粥樣硬化的診斷價值。

1 資料與方法

1.1一般資料 選擇2018年1月至2020年1月在本院收治的腦動脈粥樣硬化患者120例為研究組，其中男54例，女66例，平均年齡(61.4±11.3)歲。腦動脈粥樣硬化是指腦動脈狹窄明顯(≥50%)，所有患者均接受CT和(或)核磁共振、腦多普勒超聲、腦部超聲、腦部磁共振腦血管成像、CT血管造影或數字減影血管造影、心臟超聲檢查或其他檢查，以識別腦血管疾病和心臟病。排除患有確定或不確定病因、嚴重心臟病、近期心肌梗死或心絞痛疾病、嚴重感染、嚴重腎病或肝病、血栓性疾病或患有心臟栓塞性卒中的患者。根據動脈粥樣硬化(≥50%)時閉塞的動脈數量確定腦動脈粥樣硬化的嚴重程度，并將研究組分為單動脈組(23例)、雙動脈組(53例)和多動脈組(44例)。另選擇同期體檢健康者120例為對照組，其中男60例，女60例，平均年齡(60.5±14.2)歲。研究組和對照組性別、年齡等一般資料比較，差異均無統計學意義(P>0.05)，具有可比性。本研究得到本院倫理委員會的批準，并獲得所有參與者的知情同意。

1.2RNA提取與實時熒光定量PCR(qPCR) 2組受試者清晨抽取靜脈血3 mL。將標本儲存在未裝有任何抗凝劑的試管中，4 ℃靜置過夜，之后在室溫下以3 000 r/min的速度離心10 min，取上清液即為血清。將血清小心地轉移至Eppendorf管中，并保存至-80 ℃直至進一步處理。使用Trizol LS試劑從400 μL血清中提取總RNA (Takara，中國大連)。使用PrimeScript?miRNA cDNA合成試劑盒(Takara,日本) 反轉錄成cDNA。qPCR采用RotorGENE-3000和RotorGene6 qPCR檢測系統(Corbett Research America)一步法進行3個重復。所有miRNA引物均購自大連Takara公司。miRNA表達正常化為小核仁RNA U6。

2 結 果

2.1研究組與對照組血清miR-33a、miR-29c、miR-126的相對表達水平比較 血清miR-33a、miR-29c、miR-126的相對表達水平在研究組明顯高于對照組，差異有統計學意義(P<0.05)。見表1。

表1 研究組與對照組血清miR-33a、miR-29c、miR-126的相對表達水平比較

2.2血清miR-33a、miR-29c、miR-126單項或聯合檢測對腦動脈粥樣硬化的診斷價值分析 ROC曲線分析結果顯示，miR-33a單項檢測對腦動脈粥樣硬化診斷的ROC曲線下面積為0.95±0.02(95%CI=0.918 6～0.981 9)，當miR-33a的陽性臨界值為0.882 6，其診斷靈敏度為95.00%，特異度為95.00%。miR-29c單項檢測對腦動脈粥樣硬化診斷的ROC曲線下面積為0.93±0.02(95%CI=0.887 8～0.965 0)，當miR-29c的陽性臨界值為1.143 0，其診斷靈敏度為93.00%，特異度為92.00%。miR-126單項檢測對腦動脈粥樣硬化診斷的ROC曲線下面積為0.91±0.02(95%CI=0.871 6～0.955 3)，當miR-126的陽性臨界值為1.406 0，其診斷靈敏度為92.00%，特異度為91.00%。

將患有腦動脈粥樣硬化的定義為真陽性，未患有腦動脈粥樣硬化的為真陰性。以miR-33a的陽性臨界值0.882 6、miR-29c的陽性臨界值1.143 0、miR-126的陽性臨界值1.406 0為診斷界限，三者滿足其一者為聯合診斷陽性。血清miR-33a、miR-29c、miR-126聯合檢測對腦動脈粥樣硬化診斷的靈敏度為96.67%，特異度為90.00%，準確度為93.33%。見表2。

2.3血清miR-33a、miR-29c、miR-126在不同腦動脈粥樣硬化嚴重程度患者中的相對表達水平 血清miR-33a、miR-29c、miR-126在不同腦動脈粥樣硬化嚴重程度患者中的相對表達水平差異有統計學意義(P<0.05)；且單動脈組患者的相對表達水平均低于雙動脈組，雙動脈組患者的表達水平均低于多動脈組，差異有統計學意義(P<0.05)。見表3。

表2 血清miR-33a、miR-29c、miR-126聯合檢測對腦動脈粥樣硬化的診斷四格表(n)

表3 血清miR-33a、miR-29c、miR-126在不同腦動脈粥樣硬化嚴重程度患者中的相對表達水平

3 討 論

腦動脈粥樣硬化是缺血性卒中的最重要機制[10]。然而，目前尚未發現評估腦動脈粥樣硬化的特異性血清生物標志物[11-12]。在本研究中，血清miR-33a、miR-29c、miR-126單項檢測診斷腦動脈粥樣硬化的靈敏度分別為95.00%、93.00%、92.00%，特異度分別為95.00%、92.00%、91.00%。miRNA以高度穩定的形式存在于循環系統中,它們對核糖核酸酶、凍融循環和其他劇烈的實驗條件具有抵抗力[13-14]。血清樣品可以在-20 ℃或-80 ℃的溫度下保存數月，而不會顯著降解miRNA[15]。因此，miRNA被認為是理想的候選生物標志物。本研究結果顯示，血清miR-33a、miR-29c、miR-126聯合檢測對腦動脈粥樣硬化的診斷靈敏度為96.67%，特異度為90.00%，準確度為93.33%，顯示了較好的診斷效能。

本研究結果顯示，血清miR-33a、miR-29c、miR-126的相對表達水平在研究組和對照組差異有統計學意義(P<0.05)；血清miR-33a、miR-29c、miR-126在不同腦動脈粥樣硬化嚴重程度患者中的相對表達水平差異有統計學意義(P<0.05)。表明血清miRNA是由于發生缺血性卒中后，從受損或循環的腦細胞釋放而增加的，這與MAYR等[16]的早期研究結果一致。炎癥和免疫反應在動脈粥樣硬化的發生和發展中起關鍵作用[17]，miR-126的上調抑制了血管細胞黏附分子-1和腫瘤壞死因子α的表達，限制了白細胞對內皮的黏附，減少了與動脈粥樣硬化過程有關的炎性反應[18]。以往研究表明，miR-29c通過調節編碼細胞外基質蛋白(如膠原蛋白A和3A)的miRNA靶標來調節腦動脈粥樣硬化[19]。由miR-33a和miR-33b組成的miR-33家族是miRNA介導的脂質代謝調控最典型的miRNA之一，而脂質代謝異常是動脈粥樣硬化的基礎[20]。巨噬細胞特異性miR-33的丟失減少了高脂血癥條件下的脂質蓄積和炎癥，從而減少斑塊負擔，緩解動脈粥樣硬化[5]。抗miR-33治療是降低動脈粥樣硬化的潛在治療手段。但是，研究組血清miR-33a、miR-29c、miR-126相對表達水平升高的原因尚不清楚。血清中的miRNA可能主要是由病變細胞釋放的，因此，在細胞受傷或變性時會增加，這間接表明miR-33a、miR-29c、miR-126在腦血管系統正常發育中起重要作用。

綜上所述，血清miR-33a、miR-29c、miR-126可作為聯合診斷腦動脈粥樣硬化的潛在生物標志物。