左旋紫草素骨靶向自組裝納米粒的制備及質量表征

鄭德志，王婷婷，劉瑞杰，張 健，李城明，鄧凱文，肖雯婧，侯 君

隨著人口老齡化，我國已居世界骨質疏松癥患者數量的首位，最新統計結果顯示，我國大約有骨質疏松患者超過9000 萬[1]。 由于骨組織的硬度較大，常規治療藥物很難準確到達骨質疏松發生的部位，導致藥物的局部濃度偏低，效果不佳[2-3]。 因此，研究如何將抗骨質疏松藥物有效成分特異性遞送至骨吸收界面，抑制破骨細胞激活和分化，減少對其他組織器官的毒副作用，具有十分重要的意義。 課題組前期研究發現，中藥紫草主要有效成分左旋紫草素（l-shikonin, SK）在體外具有顯著抑制破骨細胞分化的作用，可能作為潛在治療骨質疏松藥物。 針對傳統骨質疏松藥物骨靶向性低、生物利用率低、半衰期短難以維持有效血藥濃度的問題， 本研究合成了一種新型的骨靶向性納米粒載體材料(ASP)6- PEI 包載SK，精準靶向骨組織，以達到在骨吸收界面抑制破骨細胞分化從而抗骨質疏松的作用。

1 材料與方法

1.1 試劑和儀器

1.1.1 試劑 左旋紫草素SK、 聚乳酸- 羥基乙酸共聚物PLGA（分子量15000）、天冬氨酸六肽(Asp)6、聚乙烯亞胺PEI、MBS 等購于美國Sigma 公司；二甲基亞砜DMSO、聚乙烯醇PVA、乙酸乙酯、甲醇等分析純購于西南國藥。

1.1.2 儀器 P-2 型精密電子天平（常熟市百靈天平儀器有限公司）；VORTEX-BE1 型漩渦混合器（海林市其林貝爾儀器制造有限公司）；L85-2 型磁力攪拌器（金壇市華龍實驗儀器廠）；RE301 型旋轉蒸發儀（上海科興儀器有限公司）；2211C 型超聲清洗器（上海聲彥超聲波儀器有限公司）；Optima XPN 型超高速離心機 （美國貝克曼公司）；Lab-1A-50E 型冷凍干燥機（北京博醫康實驗儀器有限公司）；UV-1780 型紫外分光光度計（日本島津公司）；DSC-100 型差示掃描量熱儀 （南京大展機電技術研究所）；Zetasizer 3000型粒度與電勢分析儀(英國馬爾文公司)；tec-10 型透射電子顯微鏡(荷蘭飛利浦公司)。

1.2 (Asp)6-PEI@SK-PLGA 自組裝納米粒的制備

1.2.1 制備SK-PLGA 采用乳化溶劑揮發法制備SK-PLGA。 精密稱定 20 mgSK 和 200 mg PLGA，溶于5 ml 乙酸乙酯，制備有機相。加入10 ml 的3%PVA 水溶液，10000 g 高速勻漿5 min， 減壓旋轉蒸發除去乙酸乙酯，0.22 μm 濾膜過濾除去未包裹的SK，4 ℃下12000 r/min 離心，冷凍干燥后即得SK-PLGA。

1.2.2 (Asp)6-PEI 共聚物的鍵合 5 mg PEI 溶解在500 μl DMSO 中，濃度為 10 mg/ml，0.5mgm-maleimidobenzoyl-Nhydoxysuccinimide ester(MBS) 加入上述溶液中，37 ℃孵育 15 min 激活 PEI。 5 mg (Asp)6短肽溶解于500 μl 超純水中， 然后逐滴加入激活的PEI中，反復混合，4 ℃交聯過夜。 通過對超純水透析清洗活性PEI 2 d，每天至少更換5 次超純水。 將溶液收集到透析管中，并冷凍干燥樣品，即得(Asp)6-PEI共聚物。

1.2.3 (Asp)6-PEI@SK-PLGA 納米粒的自組裝 將5 mg (Asp)6-PEI 共聚物用5 ml 超純水溶解，10 mg SK-PLGA 溶解于5 ml 超純水中，并攪拌混合1 h。用10 ml 蒸餾水在 4 ℃下離心（6500 r/min，10 min）洗滌3 次，冷凍干燥，獲得靜電自組裝(Asp)6-PEI@SK-PLGA納米粒。

1.2.4 (Asp)6-PEI@SK-PLGA 自組裝納米粒包封率和載藥量測定 精密稱取(Asp)6-PEI@SK-PLGA 自組裝納米粒凍干粉20 mg，溶于10 ml 甲醇溶液，超聲溶解后吸取全部上清液，過0.22 μm 濾膜，定溶后于紫外分光光度計490 nm 處以甲醇為空白測得吸光度，計算其包封率、載藥量。

載藥量=納米粒中藥物質量/納米粒質量×100%

包封率=納米粒中藥物質量/投入的總藥物量×100%

1.2.5 (Asp)6-PEI@SK-PLGA 自組裝納米粒質量表征 （1）粒徑分布和 ζ 電位測定：使用Zetasizer 3000 型粒度與電勢分析儀，測試溫度為 25 ℃，重復測試 3 次，取平均值。 （2）透射電鏡分析：將(Asp)6-PEI@SK-PLGA 自組裝納米粒稀釋后滴在銅網膜上，磷鎢酸染色干燥后觀察。 （3）差示掃描量熱DSC 測試： 分別稱定 2 mg SK-PLGA、(Asp)6-PEI、SK-PLGA和 (Asp)6-PEI 物理混合物、(Asp)6-PEI@SK-PLGA 放入 N2保護的 DSC 儀中，30~200 ℃掃描，升溫速率10 ℃/min。

1.2.6 (Asp)6-PEI@SK-PLGA 納米粒體外釋藥 取0.2 ml(Asp)6-PEI@SK-PLGA 自組裝納米粒或SK 混懸液密封于透析袋(截留分子量3500 Da)中，置于20 ml PBS 溶液(pH=7.4)中，在不同的時間點，取出 1 ml 的PBS 溶液測定SK 含量，繪制體外釋藥曲線。

2 結果

2.1 (Asp)6-PEI@SK-PLGA 自組裝納米粒外形觀察

圖1A顯示制備的(Asp)6-PEI@SK-PLGA 自組裝納米粒凍干后呈白色固體粉末，在透射電鏡（圖1B）下顯示納米粒自組裝體外形呈完整球形且形態較好，表明聚合物能完全包裹藥物。

2.2 (Asp)6-PEI@SK-PLGA 自組裝納米粒質量表征

圖1 (Asp)6-PEI@SK-PLGA 自組裝納米粒外形觀察

(Asp)6-PEI@SK-PLGA 自組裝納米粒的平均粒徑尺寸為79.24 nm， 峰形單一說明納米粒粒度分布均勻（圖 2A）；該納米粒的電位為 2.31 mV（圖2B），帶正電荷。 SK-PLGA 在134 ℃有一處明顯的吸熱峰，(Asp)6-PEI 聚合物沒有吸熱峰，(Asp)6-PEI 和 SKPLGA 物理混合物在134 ℃也有一處明顯的吸熱峰，表明是該混合物中SK 晶體的吸熱峰，而(Asp)6-PEI@SK-PLGA 自組裝納米粒在134 ℃處SK 晶體的吸熱峰消失，說明SK 以無定形態存在分布于(Asp)6-PEI@SK-PLGA 自組裝納米粒中（圖2C）。

2.3 (Asp)6-PEI@SK-PLGA 自組裝納米粒含量測定

3 批 (Asp)6-PEI@SK-PLGA 自組裝納米粒包封率和載藥量（表 1）。 結果表明，(Asp)6-PEI@SK-PLGA自組裝納米粒包封率和載藥量均較高。

2.4 (Asp)6-PEI@SK-PLGA 自組裝納米粒體外釋藥

pH 7.4 時，(Asp)6-PEI@SK-PLGA 自組裝納米粒中體外藥物釋放在24 h 內超過90%， 表明難吸收的SK 經過材料改性后，可快速釋藥（圖3）。 (Asp)6-PEI@SK-PLGA 自組裝納米粒制備形象見圖4。

表 1 (Asp) -PEl@SK-PLGA 自組裝納米粒包封率和載藥量(%)批號 包封率 載藥量20200810 10.34 96.76 20200817 10.56 97.48 20200824 10.15 97.42均值 10.63 97.22

圖 3 (Asp)6-PEI@SK-PLGA 自組裝納米粒在 pH 7.4 的PBS 中體外釋放曲線

3 討論

本課題前期研究結果表明，SK 可抑制小鼠單核巨噬細胞Raw264.7 向破骨細胞分化，在使用破骨細胞分化因子RNAKL 和巨噬細胞集落刺激因子M-CSF 誘導下，SK 處理組與對照組相比破骨細胞Trap 陽性細胞染色明顯減少，平均每個細胞細胞核數量明顯少于對照組， 證明SK 能夠在體外抑制破骨細胞的融合分化，但SK 水溶性較差，致使其生物利用率低，且SK 在體內的半衰期過短，其不能維持有效的血藥濃度。 加之其SK 在體內多器官分布廣泛從而減少了其治療骨質疏松的有效率。

圖2 (Asp)6-PEI@SK-PLGA 自組裝納米粒質量表征

1977 年聚乳酸- 羥基乙酸共聚物PLGA 被美國FDA 和歐洲EMA 批準作為藥物輔料， 是現階段研究最多的生物材料，具有良好的生物相容性和生物降解性[4-5]。由于加入了羥基乙酸，増加了聚合物的親水性，更易于調節降解速率。 由于乳酸和羥基乙酸都是體內三羧酸循環的代謝中間產物，最終降解為水和二氧化碳[6]。

研究表明，天冬氨酸六肽(Asp)6是現有主流的研究骨靶向的藥物載體材料[7]，但需要將“骨靶向”靶頭與目標分子進行化學鍵連接， 可能會改變原有藥物的活性基團，并且此類靶向載體并未解決SK 半衰期過短的缺點， 在進入骨組織后容易發生突釋[8]。因此，本研究通過SK-PLGA 和(Asp)6-PEI 共聚物自組裝既不改變藥物原有的活性基團，又能準確靶向骨組織，該材料與SK 之間同時存在靜電、氫鍵及主客體相互作用（圖 4）[9-10]。

綜上所述，(Asp)6-PEI@SK-PLGA 自組裝納米粒可使SK 在水溶液中的膠體穩定性和再分散性提高，使包裹的SK 快速釋放，加快藥物溶出。 且(Asp)6-PEI@SK-PLGA 自組裝納米粒表面帶有正電荷，有望作為生物大分子體內給藥的優選載體材料。

圖4 (Asp)6-PEI@SK-PLGA 自組裝納米粒制備形象