急性酶解血管平滑肌及Genistein 對其泡沫化的影響

盧楠娟，白 冰，何 簫，張黎明

心血管病是全球發病率和病死率的主要原因，動脈粥樣硬化(atherosclerosis,AS)是大多數心血管病發病的基礎[1-4]。 泡沫細胞形成在AS 發生、發展的各環節都發揮著重要的作用，然而目前尚沒有效逆轉AS 的方法[5]。 Allahverdian 等[6]報道發現平滑肌細胞在人類冠狀動脈粥樣硬化斑塊中比之前已知的要多， 人類AS 斑塊中許多被鑒定為單核細胞源性的泡沫細胞實際來源于平滑肌細胞。 血管平滑肌細胞（vascular smooth muscle cells，VSMC） 是構成人類AS 斑塊中的主要類型細胞[7-8],需進一步研究平滑肌源性泡沫細胞生物發生的特異性機制，以探索其在AS 中的作用。

Genistein 是異黃酮類化合物，主要在豆類植物中，可調整血脂、抗氧化、抑制血管炎癥等反應，也是天然的酪氨酸激酶 （protein tyrosine kinase，PTK）抑制劑，從而具有直接或間接抗AS 作用[9-11]。 因此，本研究探討Genistein 對平滑肌源性泡沫化的影響,為抗AS 治療提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑 8~12 周齡健康雄性維斯塔爾（Wistar）大鼠，來自哈爾濱醫科大學第二附屬醫院實驗動物中心提供，Dulbecco 改良的Eagle 培養基（dulbecco's modified eagle medium，DMEM）高糖型；胎牛血清購自ExCellBio 公司； 氧化型低密度脂蛋白(oxidized low-density lipoprotein，ox-LDL)購自廣東奕源生物公司；平滑肌肌動蛋（α-smooth muscle actin，SMA） 抗體購自 Abcam 公司；FITC 標記的山羊抗兔抗體購自美國AffinitY 公司；木瓜蛋白酶、二硫代蘇糖醇 （DL-Dithiothreitol，DTT）、 氯 化 鈣 （Calcium chloride，CaCl2）、4- 輕乙基呱嗦乙磺酸（2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid，HEPES）、油紅 O 染料、 葡萄糖（glucose,Glu）、Genistein、Daidzein、Tyrphostin等試劑購自Sigma 公司。

1.2 儀器和設備 體式顯微鏡購自日本Nikon SMZ645； 熒光顯微鏡、 倒置相差顯微鏡購自日本Olympus 公司；細胞培養箱美國Thermo 公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 腸系膜動脈平滑肌細胞（mesenteric artery smooth muscle cells，MASMC）原代分離、培養 Wistar大鼠頸椎脫臼;放血；75%酒精消毒，打開腹腔，結扎腸系膜動脈主干；體式顯微鏡下去除腸系膜動周圍脂肪組織。 取0 ℃無鈣生理鹽溶液[12]（physiological salt solution,PSS）漂洗和沖洗血管腔內殘留的血液。去除腸系膜動脈主干及末端細小分支，保留腸系膜動脈2、3 級分支。 用高壓滅菌的1%雙抗PSS 漂洗血管段，移入 1 ml 分離液(9.7 ml PSS、0.3 ml 50 mg/L牛血清白蛋白和1 μl 1 mol/L CaCl2)內，眼科剪把腸系膜動脈剪成約1 mm×1 mm 的小段。 加入1.5 mg DTT，于37 ℃水浴搖床內預熱10 min。 加入1.5 mg/ml木瓜蛋白酶溶液，37 ℃水浴搖床內孵育10 min；加入含1.5 mg/ml 透明質酸酶的分離液和1 mg/ml 膠原酶F 溶液，37 ℃水浴中孵育6 min。 再次離心,棄掉上清夜，用0 ℃的分離液漂洗，終止酶反應。2 ml 10%FBS 的 DMEM 培養基， 輕輕吹散均勻， 置于 37 ℃5% CO2培養箱3.5 mm 培養皿內培養， 分別于相應時間點1 d、5 d 后取出觀察細胞生長變化。 待細胞長到90%匯合度的時候，進行傳代培養。

1.3.2 臺盼藍染色 急性酶消MASMC 制備單細胞懸液（106細胞/ml），細胞懸液與0.4%臺盼藍溶液以9∶1 混合混勻。 血球計數板計數3 min 內活細胞和死細胞數，計算活細胞率。

1.3.3 實驗分組和處理 實驗分5 組，分組如下：對照組(細胞和高糖培養基)、模型組（50 mg/L ox-LDL）、Genistein 組（50 μmol/L Genistein 與 50 mg/L ox-LDL）、Daidzein 組(50 mg/L ox-LDL 與 50 μmol/L Daidzein)、Tyrphostin 組(50 mg/L ox-LDL 與 50 μmol/L Tyrphostin)。

1.3.4 油紅O 染色 將原代平滑肌細胞以1×105/孔接種12 孔板，4 h 后待細胞貼壁加入含50 mg/L ox-LDL 的 10%FBS 的 DMEM 培養 24 h，PBS 漂洗，40 g/L 多聚甲醛固定15 min，60%異丙醇潤洗，每孔加入 0.5 ml 過濾好的油紅 O 染色 30 min，PBS 漂洗，倒置顯微鏡下觀察泡沫細胞染色。

1.3.5 油紅萃取實驗 上述油紅O 染色后， 每孔加入0.5 ml 異丙醇萃取細胞內油紅O 染色液，取100 μl 加入 96 孔板，518 nm 處測其吸光值，定量檢測細胞內脂質含量。

1.3.6 免疫熒光化學染色 取第3 代細胞， 每孔1×105個細胞接種于12 孔板內，細胞匯合度60%時，PBS 漂洗，4%多聚甲醛固定10 min； 磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered solution，PBS）漂洗，0.1%TritonX-100 透膜孵育 5 min；PBS 漂洗，10%山羊血清封15 min； 兔抗鼠 α-SMA 抗體 (1∶200)4 ℃孵育過夜，PBS 漂洗，FITC 標記的山羊抗兔 IgG(H 與 L)(1∶100)避光孵育細胞 60 min；PBS 漂洗，DAPI 避光染核5 min；PBS 漂洗，抗淬滅劑封片，倒置熒光顯微鏡下觀察培養的 MASMC 胞漿內肌動蛋白被α-SMA 標記后呈綠色熒光， 胞核被4,6- 二脒基-2- 苯基吲哚(4,6-diamidino-2-phenylindole，DAPI)染成藍色。 隨機選取4 個不同的視野， 計算α-SMA 表達陽性百分比，鑒定 VSMC 及檢測α-SMA 的表達。

1.4 統計學方法 應用Graph pad prism8.0 軟件作圖， 對數據進行統計學分析， 實驗數據以x±s 表示，多組均數比較采用單因素方差分析，兩組之間比較采用t檢驗，P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 兩步法急性酶解分離并原代培養MASMC兩步法急性酶解分離可得到大量同源單個MASMC,顯微鏡下觀察MASMC 呈長梭形（圖1A）。培養24 h細胞呈圓形或梭形， 貼壁良好(圖1B)； 培養 5 d 后VSMC 具有典型的“峰 -谷”結構（圖1C）。

2.2 細胞活力鑒定 死亡的MASMC 被臺盼藍染成藍色，活性良好MASMC 拒染呈無色。急性酶解獲取MASMC 活性達 99%以上（圖2）。

2.3 MASMC 的鑒定 α-SMA 是鑒定 VSMC 的標記分子[13]。 熒光顯微鏡下觀察到，α-SMA 表達陽性率占95%（圖4），表明分離培養的是高純度VSMC，可用于后續實驗。

2.4 ox-LDL 與MASMC 共培養建立泡沫細胞模型ox-LDL（50 mg/L）誘導 MASMC 發生泡沫樣變。ox-LDL 刺激24 h 后， 油紅O 染色顯示細胞吞噬油紅脂質，細胞變圓，體積增大（圖3B）,提示泡沫細胞模型建立成功。

圖 1 MASMC 形態和生長特點（×100）

圖 2 MASMC 臺盼藍染色（×100）

2.5 Genistein 抑制泡沫細胞的形成 油紅O 染色實驗顯示模型組與對照組(圖3A)相比吞噬大量紅色脂滴(P< 0.01)，Genistein 組與模型組相比吞噬紅色脂滴顯著減少(P< 0.05),而Daidzein 組吞噬紅色脂滴無明顯變化(P> 0.05)，Tyrphostin 組吞噬紅色脂滴顯著減少(P< 0.05，圖3)；油紅萃取結果顯示模型組較對照組增高 1.72 倍(P< 0.05)，Genistein 組較模型組降低了 1.18 倍(P< 0.05)，而Daidzein 組較模型組增高 1.12 倍(P＞ 0.05)，Tyrphostin 組較較模型組降低了 1.22 倍(P< 0.05)。

2.6 Genistein 促進泡沫細胞表達α-SMA 與對照組相比， 模型組 α-SMA 表達明顯降低（P< 0.01）；Genistein 組與模型組相比 α-SMA 表達增多（P<0.05）,Daidzein 組與模型組相比α-SMA 表達無明顯變化，Tyrphostin 組與模型組相比α-SMA 表達增多（P< 0.05，圖 4）。

3 討論

目前報道了人和鼠VSMC 原代培養方法，主要包括組織貼塊法[14-16]和酶消化法[14-17]，酶分離法經過不斷的改進，越來越顯示其優越性。 本實驗參考國內外文獻中VSMC 的分離方法， 使用木瓜蛋白酶和膠原酶兩步法，成功地分離出大鼠MASMC。 組織塊[15-17]培養需要2~3 w，甚至更長時間，本實驗采用木瓜蛋白酶和膠原酶分離MASMC 僅需1 h；組織塊培養時容易混入內皮細胞和成纖維細胞獲得的VSMC 純度低是一個嚴重的缺點，而本研究條件下內皮細胞不易存活[18]；用免疫熒光鑒定VSMC 的特異性標志蛋白α-SMA 陽性率達95%；臺盼藍染色顯示細胞活性達99%以上；一旦用酶消化分離，原代培養的血管平滑肌細胞就保持了原來的表型。 因此，本研究克服了以往組織培養方法的缺點，建立了一種周期短且可靠的分離和培養高純度、細胞活性良好、易獲取大量同源單個細胞并保持原有特性的大鼠MASMC 的方法，對后續實驗研究不會產生偏差。

圖3 油紅O 染色(×200)和油紅萃取結果(n=3)

圖 4 VSMC 的 α-SMA 表達（× 200）

長期以來， 血脂異常一直被認為是AS 相關冠狀動脈和外周血管疾病的獨立危險因素，也是許多干預措施的靶點[19-20]。 ox-LDL 對血管壁成分的生物學效應在AS 中起著重要作用[21]。傳統的觀念認為泡沫細胞主要來源于巨噬細胞，而研究證實在人冠狀動脈斑塊中超過50%的泡沫細胞來源于VSMC[6]。因傳代細胞可能發生轉化，本研究采用急性酶解獲取原代VSMC，更接近與人體狀態。 用50 mg/L ox-LDL作用24 h 后成功誘導VSMC 源性泡沫細胞模型，油紅 O 染色發現細胞吞噬大量脂滴，ox-LDL 誘導VSMC 泡沫化，細胞完整，并未發生嚴重凋亡壞死而影響后續實驗。

Genistein 具有抗氧化、 調節血脂等抗AS 的作用[22]，Genistein 是一種 PTK 抑制劑，可以抑制平滑肌源性泡沫細胞表型的轉化[23]，為了進一步研究Genistein 抗AS 的作用機制， 本研究采用Daidzein與 Genistein 比較，Daidzein 具有與 Genistein 相似的結構，但Daidzein 沒有抑制PTK 的作用。 研究發現Daidzein 不影響平滑肌泡沫化，Genistein 抑制平滑肌細胞泡沫化，那么Genistein 對脂質的調節作用可能與其抑制PTK 活性有關。 為此，同時研究了另一種PTK 抑制劑Tyrphostin 對平滑肌細胞泡沫化影響。結果發現，Tyrphostin 抑制平滑肌細胞泡沫化，表明Genistein 抑制脂質的蓄積與依賴于PTK 抑制劑的生物活性相關。 內膜平滑肌細胞發生表型轉換同樣參與了動脈粥樣硬化的發展，本實驗證明ox-LDL誘導α-SMA 的表達降低，與SMCs 的收縮性表型的缺失相關。目前對Genistein 的研究還未受到學術界的重視， 本研究表明Genistein 具有良好地抑制VSMC 源性泡沫細胞形成的作用， 為進一步研究抗AS 治療提供了理論依據。

綜上所述，酶解法可獲取大量同源的單個高純度高活性VSMC，Genistein 抑制ox-LDL 誘導的平滑肌源性泡沫細胞的形成，與其抑制PTK 的生物活性作用有關，為指導臨床應用提供參考。