丫蕊花皂苷P 的抗白色念珠菌活性研究

司馬全，王 平，曹林森，徐貴麗

白色念珠菌(Candida albicans，CA)是一種普遍存在的條件性致病菌，也叫白假絲酵母。 白色念珠菌也是目前最主要發生侵襲性念珠菌感染的病原。 丫蕊花屬(Ypsilandra Franch.)為百合科(Liliaceae Juss.)多年生草本植物,全草具有清熱解毒等功效。甾體皂苷作為丫蕊花的主要活性成分，在近幾年大量研究中發現其具有抗腫瘤、抗菌、止血等多種生理活性。本試驗研究丫蕊花皂苷P 的抗白色念珠菌效果。

1 材料與方法

1.1 藥物與試劑 丫蕊花皂苷P[1]（ypsilandroside P,純度≥97%）,由解放軍920 醫院藥學部臨床微生物實驗室前期制備，丫蕊花皂苷P 化學結構式見圖1；氟康唑氯化鈉注射液（fluconazole，FLC），輝瑞制藥有限公司，批號：A490705； 注射用環磷酰胺（cyclophosphamide，CTX），百特國際有限公司，批號：6C105A。

圖1 丫蕊花皂苷P 結構式

1.2 供試菌種 實驗菌株標準菌株：CA(ATCCY0109和ATCCSC5314)采購自中國藥品生物制品鑒定所。分離耐藥菌株：CA 耐藥菌(CA632、CA592、CA953、CA819、CA152、CA100、CA649、CA956)， 均由第 920醫院藥學部臨床微生物實驗室提供。

1.3 實驗動物 無特定病原體（SPF）級巴比賽（BALB/c）小鼠，雌性，6～9 w，18～22 g[昆明醫科大學實驗動物中心，實驗動物生產許可證：SYXK（滇）K2015-0002]。 于實驗室適應性飼養1 w 后再進行實驗。

1.4 實驗方法

1.4.1 藥液制備 制備藥液： 將丫蕊花皂苷P 以含10%二甲基亞砜的生理鹽水作為溶劑，配置成濃度為4.096 mg/ml 的藥液。 陽性藥液的制備：將氟康唑用生理鹽水配置為16 μg/ml 的藥液以備用。

1.4.2 丫蕊花皂苷P 的最小抑菌濃度（MIC）的測定 參考CLSI 2017 版指南（CLSI:M07-A10, 2017）中微量液體培養基倍比稀釋方法，測定丫蕊花皂苷P 對不同的白色念珠菌細胞的MIC 值。 重復3 次后數據取平均值。

1.4.3 最低殺菌濃度 （MBC） 的測定 確定MIC后，用接種環分別蘸取每個菌種MIC 值前3~5 個孔的培養液，轉接種于相應的瓊脂平板上，置于恒溫培養箱中35 ℃培養24 h。 用活菌計數法檢查瓊脂平板上的菌落，菌落平均數<5 個最小藥物濃度即為次藥的MBC。

1.4.4 棋盤式微量稀釋法[2]采用棋盤法測量丫蕊花皂苷P 是否與抗菌藥物有聯用效果。 將氟康唑與丫蕊花皂苷P 分別于96 孔板上的縱向和橫向兩個方向分別進行倍比稀釋。 將培養板置于35 ℃培養箱中孵育18~24 h 觀察結果。每組重復3 次后數據取平均值。 部分抑菌濃度及FICI 的計算方法參考文獻[3-4]。

1.4.5 時間殺菌曲線法[5]采用時間- 殺菌曲線法進行試驗，根據棋盤法所測定的FICI 的數值，選擇結果為相加或協同作用的組合，進一步研究這種化合物和其他抗菌藥之間聯合的一種動態聯合殺菌作用。 根據棋盤法實驗測定的各藥單用及聯用MIC 設置各組用藥濃度。 每組重復3 次后數據取平均值。 判斷標準：如兩藥聯合后，與單用效果最好組比較，降低值＞2 log10CFU/ml，則認為二者有協同作用；降低值為1~2 log10CFU/ml，則認為二者為相加作用；降低或增加值為1 log10CFU/ml，則認為二者為無關作用；若兩藥聯合使用后增加值大于1 log10CFU/ml，則認為兩藥有拮抗作用。

1.4.6 侵襲性白色念珠菌感染模型的建立與評估[6]巴比賽小鼠隨機分為環磷酰胺組和生理鹽水組，每組10 只、環磷酰胺組給藥方案為：每日腹部注100 mg/kg 環磷酰胺，連續3 d 進行免疫抑制；生理鹽水組則腹腔注射同劑量的生理鹽水作為對照。以第1 d 和第4 d 的體重，外周白細胞數，脾臟體重系數作為指標，判斷免疫抑制模型建立是否成功。

脾臟體重系數＝脾臟重量/體重×100（mg/10 g）

1.4.7 丫蕊花皂苷P 給藥生存率評價 免疫抑制小鼠隨機劃分為8 組： 免疫抑制組、 感染對照組﹑FLC 0.5 mg/kg 組﹑1 mg/kg 組﹑2 mg/kg 組、丫蕊花皂苷 P 0.5 mg/kg 組、1 mg/kg 組、2 mg/kg 組（n=10）。 每只小鼠側尾靜脈注射0.2 ml 濃度為1×107CFU/ml的菌懸液， 建成侵襲性白色念珠菌感染小鼠模型。感染2 h 后，分組灌胃給藥，每天0.1 ml，免疫抑制組和感染對照小鼠給予等量生理鹽水， 連續5 d 給藥，觀察12 d 后小鼠的死亡狀況，繪制生存曲線。

1.4.8 白色念珠菌感染小鼠臟器菌落計數[7]將免疫抑制模型小鼠隨機分為7 組：感染對照組﹑FLC 0.5 mg/kg 組﹑1 mg/kg 組﹑2 mg/kg 組、 丫蕊花皂苷 P 0.5 mg/kg 組、1 mg/kg 組、2 mg/kg 組。 侵襲性白色念珠菌感染小鼠模型連續給藥5 d 后脫頸處死各組小鼠（n=6），立即取心臟、肝臟、腎臟并稱重后用無菌玻璃勻漿器勻漿后用0.9%生理鹽水不同稀釋倍數稀釋后取勻漿液30 μl 涂布于沙氏瓊脂培養基培養板上， 每個樣品平行3 塊板，35 ℃恒溫培養箱中靜止培養24 h 后取出進行計數。

2 結果

2.1 丫蕊花皂苷P 的MIC 和MBC 及與氟康唑聯合用藥的效果評價 丫蕊花皂苷P 對白色念珠菌標準菌（CAY0109、CASC5314）及耐藥菌（CA632、CA592、CA953、CA819、CA152、CA100、CA649、CA956）的 MIC值分布為 2~4 μg/ml，MB (F)C 值分布為 4~8 μg/ml，見表1。 棋盤法測定結果見表2。

2.2 時間殺菌曲線 根據棋盤法試驗結果， 測試丫蕊花皂苷P 單用、與氟康唑聯合用藥及氟康唑單用對用棋盤法所篩選出的菌株的抗菌效果。 結果見圖 2（A、B、C）。

表1 丫蕊花皂苷P 單用對10 種菌株的MIC/MB(F )C 值(n=3)

圖2A 丫蕊花皂苷P 與氟康唑抗CAY0109 時間殺菌曲線

2.3 體內抗菌實驗結果

2.3.1 侵襲性白色念珠菌感染模型的建立與評估

連續3 d 腹腔注射100 mg/kg 環磷酰胺免疫抑制后，各組小鼠體重、白細胞數、脾臟系數如表3、4所示。

圖2B 丫蕊花皂苷P 與氟康唑抗CA632 時間殺菌曲線

圖 2C 丫蕊花皂苷P 與氟康唑抗CA152 時間殺菌曲線

2.3.2 丫蕊花皂苷P 給藥治療白色念珠菌感染小鼠療效觀察 白色念珠菌感染小鼠分組進行給藥治療后生存曲線見圖3。

2.3.3 白色念珠菌感染小鼠給藥治療后臟器菌落計數 白色念珠菌感染小鼠給藥治療后臟器菌落計數結果見圖 3（A、B、C）。

3 討論

目前的研究表明，白色念珠菌耐藥性和其機理可能由于靶酶基因突變或表達、藥物外排泵基因過表達、真菌細胞膜的通透性變化，使藥物很難進入細胞。 許多研究表明，一些從中藥提取的單體化合物，可以通過抑制藥物外排泵基因表達，誘導真菌細胞內的活性氧上升，損傷真菌細胞壁或細胞膜的結構，從而達到抑菌作用[8]。

表2 棋盤式微量稀釋法測定丫蕊花皂苷P 與氟康唑聯用結果(n=3)

表3 小鼠侵襲性白色念珠菌感染模型體重與白細胞數(,n=10)

表3 小鼠侵襲性白色念珠菌感染模型體重與白細胞數(,n=10)

注:與CTX組第1 d 比較,①P < 0.01

生理鹽水組第1 d 19.6±0.5 8.01±0.09 CTX 組第 1 d 19.4±0.6 7.98±0.12生理鹽水組第4 d 19.8±0.4 8.02±0.11 CTX 組第 4 d 16.8±0.5 2.53±0.52

表4 小鼠侵襲性白色念珠菌感染模型脾臟系數(? s,10)n=

表4 小鼠侵襲性白色念珠菌感染模型脾臟系數(? s,10)n=

注:與生理鹽水組比較,①P ＜ 0.01

組別 脾臟系數

圖3 小鼠給藥治療后生存曲線（n=10）

圖4A 白色念珠菌感染小鼠給藥治療后心臟菌落計數

圖4C 白色念珠菌感染小鼠給藥治療后腎臟菌落計數

本實驗研究了丫蕊花皂苷P 抗多個白色念珠菌菌株的活性。棋盤法結果見表2，丫蕊花皂苷P 與氟康唑聯用時，對菌株Y0109、632 及152 有協同作用。 時間殺菌曲線結果如圖2A，丫蕊花皂苷P 與氟康唑抗CAY0109 結果表明，12 h 時聯合用藥與對照組相比，菌濃度 log10 CFU/ml 降低值＞1，表明聯合用藥有顯著相加作用；如圖2B，丫蕊花皂苷P 與氟康唑抗CA632 結果表明，12 h 時聯合用藥與對照組相比，菌濃度 log10 CFU/ml 降低值＞2，表明聯合用藥有顯著相協同作；如圖2C，丫蕊花皂苷P 與氟康唑抗CA152 結果表明，24 h 時聯合用藥組與單用組相比，菌濃度log10 CFU/ml 降低值>2，故兩者聯合用藥有協同作用。其中兩者聯合抗CAY0109 和抗CA632 的效果于12 h 左右最佳，而后隨時間增長抗菌效果也逐漸消失，這可能是由于聯合抗菌用藥濃度較低導致。 且丫蕊花皂苷與P 氟康唑聯用時的氟康唑MIC 均比氟康唑單用時的MIC 有所降低，說明丫蕊花皂苷P 有一定的抗耐藥效果。

侵襲性白色念珠菌感染模型建立實驗結果顯示： 連續3 d 腹腔注射100 mg/kg 環磷酰胺免疫抑制后， 環磷酰胺組小鼠的體重與第1 d 相比顯著減輕(P< 0.01)，而生理鹽水小鼠的第4 d 和第1 d 相比沒有明顯的體重差異， 見表4； 小鼠白細胞數(white blood cell,WBC )結果顯示，環磷酰胺組小鼠的白細胞數在第4 d 和第1 d 相比明顯減少(P<0.01)，而生理鹽水組小鼠第4 d 與第1 d 相比白細胞數與無顯著性差異；脾臟的體重系數結果見表5，第4 d環磷酰胺組和生理鹽水組的脾臟重量系數比，前者脾臟的體重系數明顯下降(P< 0.01)。 參照文獻[8]，小鼠的白細胞數連續3 d 下降70%， 表明免疫抑制的成功，即連續3 d 每日腹腔注射環磷酰胺100 mg/kg可以成功地對小鼠實施免疫抑制。

體內實驗結果表明各組小鼠中位生存時間分別為：感染對照組 5 d﹑FLC 0.5 mg/kg 組 7 d﹑FLC 1 mg/kg 組 10 d、丫蕊花皂苷 P 0.5 mg/kg 組 5 d、丫蕊花皂苷P 1 mg/kg 組6 d、丫蕊花皂苷P 2 mg/kg 組8 d。與感染對照組相比，FLC 0.5 mg/kg 組和FLC 1 mg/kg組小鼠生存率提高、中位生存時間延長，均具有統計學差異（P< 0.01）；丫蕊花皂苷P 各組小鼠的中位生存時間均較感染對照組有所延長，但只有丫蕊花皂苷P 2 mg/kg 組小鼠的中位生存時間差異有統計學意義（P<0.05）。 實驗結果說明丫蕊花皂苷P 在體內具有抗白色念珠菌活性。

在臟器菌落計數實驗結果顯示， 給藥治療后，各臟器中1 mg/kg FLC 及2 mg/kg FLC 組的菌落數與對照組相比顯著下降，且差異隨給藥劑量的增大而增大。 在肝臟中3 個劑量濃度的丫蕊花皂苷P 與對照組相比，差異無統計學意義（P> 0.05），在心臟和腎臟中只有2 mg/kg 丫蕊花皂苷P 與對照組相比菌落數降低（P< 0.01）。

白色念珠菌耐藥卻是一種復雜的多因素作用過程，它涉及到多個因素的參與，丫蕊花皂苷P 具體的抗菌機制還需進一步深入研究。