大柴胡湯治療高血壓病潛在機制的網絡藥理學研究*

陳凱明，李焱，薛一濤

1.山東中醫藥大學，山東 濟南 250355； 2.山東中醫藥大學附屬醫院，山東 濟南 250014

高血壓病作為一種慢性疾病，以動脈血壓增高為主要特征，持續高動力性循環狀態將出現一系列心、腦、腎等靶器官的損傷。目前我國成人高血壓病發病率為27.9%，與此同時正常高值血壓人群出現逐年增長趨勢[1]。《2020國際高血壓學會全球高血壓實踐指南》[2]結合全球的流行病學特征，立足不同國家和地區經濟、醫療資源水平，針對性提出了“基本”及“理想”兩個血壓管理標準，重點強調了“降血壓是硬道理”的觀點。循證醫學和臨床研究進一步表明，西藥仍是當下調控血壓，減少靶器官損害的主體。相較其不良反應，中醫藥在防治高血壓病的進程中發揮了獨特的優勢[3]。尤其是經方以其獨特的辨證體系，針對高血壓病的致病特點，提出了火邪上擾、氣機逆亂、痰飲內阻3個高血壓病的病機特點[4]。臨床上大柴胡湯、半夏白術天麻湯、真武湯等系列經典名方在“方證相應”的指導下，對于高血壓病的治療發揮了良好的功效[5]。

大柴胡湯源于《傷寒論》，為主治少陽、陽明合病的代表方，主治胸脅苦滿，嘔不止，郁郁微煩，心下痞硬，或心下滿痛，大便不解[6]。以少陽樞機不利，郁熱內結為主要病機。《黃帝內經》載：“逆春氣則少陽不升，肝氣內變。”肝膽同司少陽的生發系統，若肝膽之氣失于升發，則肝氣內郁，郁而為病，出現化火、生風、動血等證候。“有是證，用是方”，對于臨床上表現為眩暈、頭痛、煩躁易怒、胸脅不適、腹滿等肝郁化火的高血壓病患者，用大柴胡湯疏肝解郁，通腹瀉熱往往取得良效。然而，目前大柴胡湯治療高血壓病僅限于文獻研究和臨床報道，缺少分子、基因層面的深入研究。本研究將借助網絡藥理學方法，系統、全面地揭示大柴胡湯的作用機制，探索更多的降血壓通路，更好發揮中醫藥對高血壓病的防治作用[7]。

1 資料與方法

1.1 大柴胡湯活性成分篩選和潛在靶點檢索借助中藥系統藥理學數據庫及分析平臺(TCMSP)[8]篩選出柴胡、黃芩、半夏、枳實、芍藥、大黃、生姜、大棗所含化學成分。以同時符合口服生物利用度(oral bioavailability，OB)≥30%，類藥性(drug like，DL)≥0.18為主要藥代動力學參數，篩選出8味藥物的主要活性成分[9-11]。將收集到的有效成分導入PubChem數據庫檢索SMILE結構，根據“配體之間相似性分布”原理采用Swiss Target Prediction數據庫檢索成分對應靶點，利用Uniprot數據庫實現蛋白-靶點之間標準轉化。

1.2 大柴胡湯“藥物-化合物-靶點”網絡一體化構建為了構建“藥物-化合物-靶點”一體化網絡圖，采用Cytoscape3.6.1生物可視化軟件，充分展示藥物、化合物、靶點三者之間交互作用關系[12]。

1.3 高血壓病靶點預測以“Hypertension”為關鍵詞分別在OMIM、GAD、DisGeNET、PharmGKB、TTD、DrugBank 6個不同的數據庫中檢索高血壓病相關靶點，整合檢索結果，刪除重復靶點，構建高血壓病靶點數據庫[13]。

1.4 直接作用靶點獲得及蛋白質相互作用網絡構建與分析將活性成分靶點與上述構建的高血壓病靶點通過在線bioinformatics工具繪制藥物-疾病韋恩圖，并分析得到大柴胡湯治療高血壓病的映射靶點。將成分-疾病映射靶點導入STRING數據庫中進行PPI構建，將置信度0.7(high confidence)作為設定閾值，分析得到蛋白質相互作用(PPI)網絡圖。

1.5 拓撲分析和關建靶點篩選在生物學進程中，關鍵基因往往調控并影響其他基因功能的發揮[14]。將PPI數據以tsv格式導入Cytoscape3.6.1軟件，運用CytoNCA插件對PPI網絡進行拓撲分析，獲得網絡拓撲參數；根據自由度(Degree)、介數(Betweenness Centrality)、接近中心性(Closeness Centrality)3個主要參數進行拓撲篩選，得到關鍵靶點[15]。

1.6 基因GO富集分析和KEGG信號通路分析利用Cytoscape3.6.1中的ClueGO插件，以(P<0.01)為閾值，對直接作用靶點進行分子功能(Molecular Function)、細胞組成(Cellular Component)富集分析；生物過程(Biological Process)運用 Funrich version3軟件[16]，進行通路注釋。通路富集分析采用經典的Davidv在線分析工具對直接作用靶點進行KEGG通路富集分析，以P<0.01作為條件進行篩選，根據每條通路富集基因的數量，篩選出具有顯著差異的作用通路。

2 結果

2.1 大柴胡湯主要活性成分和預測靶點TCMSP數據庫中共檢索到8味中藥相關活性成分760個，進行ADME篩選，刪除重復成分，整合得到97個主要活性成分。參照相關的藥理學報道，列舉每味藥物代表性化合物的基本信息，見表1。例如MOL0358(β-谷甾醇)是生姜、大棗、白芍、半夏 大黃和黃芩共有的化合物；MOL0098(槲皮素)是大棗、柴胡共有的化合物；而MOL0422(山柰酚)是柴胡和白芍共有的潛在化合物。

表1 大柴胡湯中20個代表性化合物信息表

2.2 大柴胡湯“中藥-化合物-靶點”網絡圖構建通過Cytoscape 3.6.1可視化軟件充分展示了“藥物-化合物-靶點”三者之間的網絡圖，大柴胡湯97個主要活性成分，與170個成分對應的靶點存在 2 640 條互作關系，“中藥-化合物 -靶點”網絡圖見圖1。

圖1 中藥-化合物-靶點網絡圖

2.3 高血壓病主要靶點根據人類遺傳、疾病基因、藥物基因組學基因的不同特性，在6個不同的數據庫中檢索到“Hypertension”相關基因共1 757個，進行整合分析，刪除共有靶點，得到1 169個高血壓病靶點。

2.4 直接作用靶點篩選170個活性成分靶點與 1 169 個高血壓病相關靶點相互映射，最終得到84個成分-疾病直接作用靶點，見圖2。

圖2 活性成分-疾病直接作用靶點圖

2.5 大柴胡湯PPI網絡的構建及關鍵靶點拓撲篩選通過String數據庫，建立84個直接作用靶點蛋白質相互作用網絡圖。將String中下載的tsv文件導入Cytoscape3.6.1，采用CytoNCA插件對PPI網絡進行拓撲分析，得到一個由79個節點和218條邊組成的網絡(圖3A)。第一次篩選以Degree(DC)、介數(BC)和接近中心性(CC)大于中位數進行篩選，得到22個節點和76條邊的網絡圖(圖3B)；二次篩選以Degree大于中位數的2倍進一步篩選，最終構建11個節點和37條邊的大柴胡湯作用于高血壓的核心靶點網絡圖(圖3C)。用節點的大小表示Degree的大小，11個關鍵靶點依次為：IL-6、PTGS2、EGF、VEGFA、JUN、IL-1β、TNF、NOS3、F2、HMOX1、HTR2C詳見表2。

表2 大柴胡湯治療高血壓關鍵靶點基本信息表

注：A直接作用靶點蛋白相互作用網絡圖；B根據度(DC)、介數(DC)和接近中心性(CC)第一次篩選后網絡圖；C在第一次刪選基礎上根據度(DC)進一步篩選網絡圖

2.6 大柴胡湯直接作用靶點GO功能富集分析通過對直接作用靶點GO富集分析發現，分子層面主要涉及蛋白結合、蛋白質活性、酶結合、受體結合等方面；細胞組成層面主要涉及細胞質膜、膜的組成、細胞外間隙、細胞溶質等，見圖4。運用Funrich version3分析84個直接作用靶點的生物過程，主要涉及細胞信號轉導、細胞訊息傳遞、能量通道、新陳代謝等，見圖5。

注：A分子功能；B細胞組成

圖5 大柴胡湯治療高血壓病的生物過程示意圖

2.7 大柴胡湯KEGG通路富集分析利用DAVID數據庫進行KEGG通路富集分析，共獲得55條通路，根據P<0.01篩選得到25條相關通路，根據每條通路富集基因的數量，對前10條通路進行可視化處理，見圖6。通過查閱文獻大柴胡湯可能通過神經活性配體-受體相互作用通路(Neuroactive ligand-receptor interaction)、鈣信號通路(Calcium signaling pathway)、腫瘤壞死因子信號通路(tumor necrosis factor signaling pathway)、血管表皮生長因子信號通路(vascular endothelial growth factor signaling pathway)等多途徑治療高血壓病。

注：Y軸代表pathway名稱，X軸代表Ratio，氣泡顏色代表富集的顯著性，即P值的大小，氣泡面積基因集中于這個pathway的基因數量，即Count值

3 討論

中藥藥理學技術的快速發展，一定程度上促進了中藥及其復方制劑有效成分對降血壓機制的研究。目前中醫防治高血壓病的作用機制主要從阻斷腎素-血管緊張素-醛固酮系統激活、抑制交感神經系統活性亢進、改善胰島素抵抗、抗炎利尿等多個方面發揮對血壓的調控作用[17]。與此同時，中藥復方的復雜性、藥物基礎不明、基礎與臨床研究脫節等一系列問題成為深入研究的瓶頸。本研究充分發揮網絡藥理學系統性、整體性的優勢，以經方大柴胡湯治療高血壓病為切入點，為拓寬中醫藥防治高血壓病的治療途徑做出有益探索。

分析藥代動力學篩選結果，得到大柴胡湯97種性質較好具有代表性的化合物。其中β-谷甾醇、兒茶素、黃芩素、槲皮素、蘆薈大黃素等多種活性成分均具有良好的抗高血壓相關作用。研究發現，β-谷甾醇是植物甾醇類成分之一，具有抗氧化、抗炎、降低膽固醇、調節免疫等功效，可通過調節脂質代謝，減少脂質在血管內的堆積，增強血管彈性，使血壓下降[18]。白芍、大棗中所含的兒茶素被譽為“血管穩定劑”，通過促進NO的釋放，改變內皮細胞的血流動力以及抑制血小板聚集，促進血紅素氧化酶的表達以維持體內血壓平衡，具有強效的降血壓活性[19]。本研究也證實了靶點凝血酶、血紅素加氧酶在整個復方中發揮重要的降血壓作用。黃芩素、槲皮素、蘆薈大黃素等均可通過抑制炎癥免疫反應，作用于血管內皮細胞，直接或間接參與抗高血壓病的作用[20-22]。大柴胡湯良好的活性成分為進一步探討其抗高血壓病的機制研究提供藥效物質基礎。

結合KEGG富集所獲得的高血壓病相關通路與通路上所富集的關鍵靶點，進一步分析發現，大柴胡湯可能通過參與免疫炎癥反應、改善血管內皮功能、血管的舒縮、血液流變學等多個環節治療高血壓病。近年來越來越多的研究發現，多種炎癥因子參與了高血壓病的發生發展，高血壓病被視為一種慢性低度炎癥性疾病[23]。本研究發現IL-6、IL-1β、TNF、PTGS2為主的關鍵靶點均富集在TNF信號通路上，高血壓病的進展與發生可能與炎癥免疫疾病的發生密切相關。臨床研究證實，相比健康人群，高血壓病患者血清中TNF-α和IL-6水平與疾病程度呈正相關[24]。以往研究表明，TNF-α直接通過細胞毒性作用，對血管的內皮結構和功能造成破壞。同時TNF-α還可以與血小板源生長因子誘導單核細胞和纖維細胞產生 IL-6[25]。兩者共同促進血管平滑肌細胞增殖，引起血管內皮細胞壞死，導致血栓形成，控制脂溶酸活性，抑制脂蛋白脂酸活性與脂質溶解，脂質沉積于血管壁，加速動脈粥樣硬化[26]。近年來，保護血管內皮功能和抑制血管重構亦是高血壓病領域研究聚焦的熱點方向[27]。高血壓病患者隨著病程的增長往往伴有血管內皮損傷，同時刺激產生和釋放包括內皮素在內的血管收縮因子以及各種生長因子。內皮舒張因子及收縮因子的失衡，促進氧化應激、激活炎癥反應、活化血小板聚集，最終導致內皮依賴性舒張功能障礙[28]。有學者研究發現，血管內皮生長因子通過提高微血管的通透性，促進炎性細胞滲入，使內皮細胞發生增殖、遷移、分化，同時抑制其凋亡[29]。本研究在VEGF signaling pathway信號通路中發現有大柴胡湯與高血壓病共同直接作用靶點PLA2G4A、PTGS2、VEGFA、NOS3、KDR。因此，推測大柴胡湯可能通過調節VEGF signaling pathway通路治療高血壓病。鈣信號通路(Calcium signaling pathway)廣泛參與人體各個生理病理活動。研究發現細胞內鈣離子水平升高是高血壓病形成的重要機制，血管平滑肌細胞的收縮是通過鈣離子細胞形態實現的。當鈣離子通道開放時，平滑肌收縮，相反，選擇性阻斷鈣離子通道可以阻滯鈣離子向細胞內發生轉移，使細胞內鈣離子濃度降低，平滑肌恢復松弛，達到舒張血管和降低血壓的目的[30-31]。其他一些信號通路諸如神經活性配體受體相互作用信號通路(Neuroactive ligand-receptor interaction)，通過參與自主神經和大腦皮層的活動對血壓產生調節作用。

綜上所述，在網絡藥理學研究的基礎上，根據預測的關鍵靶點和通路表明，大柴胡湯治療高血壓的可能機制：①參與炎癥反應、血管舒張、改善血管內皮功能等多靶點參與血壓的調控作用；②通過腫瘤壞死因子信號通路、血管內皮生長因子信號通路、鈣信號通路、神經活性受體通路等多通路發揮降血壓作用。為進一步深入探討大柴胡湯治療高血壓的作用機制提供參考依據。由于網絡模型并不能完全揭示藥物在生物體內狀況，因此，分析出的作用靶點和潛在的通路機制還需進一步實驗證實[32]。