元七膠囊改善小鼠失眠的機制

隋得志 李 然 李 巖 趙 巖 管 桐 高麗莎 王斌勝

1 濱州醫學院中西醫結合學院 山東 煙臺 264003； 2 煙臺市中醫院 山東 煙臺 264001；3 濱州醫學院附屬醫院 山東 濱州 256603

失眠主要是指睡眠持續時間不足和(或)睡眠質量差，其特征為入睡困難和難以保持睡眠[1]。根據美國睡眠協會公布的數據顯示，美國有5 000萬到7 000萬成年人患有睡眠障礙，每年與失眠相關造成的損失超過1 000億美元[2]。失眠不僅發病率高，長期失眠還會導致患者對生活質量的感知差，甚至導致抑郁癥、高血壓、2型糖尿病等[3-6]。更有Meta分析顯示，失眠與死亡增加有相關性[7]。

失眠在《內經》中稱為“目不瞑”、“不得眠”、“不得臥”，與陰陽失衡、營衛失度、五臟不安等有關，治療以半夏秫米湯、朱砂安神丸、酸棗仁湯、炙甘草湯、黃連溫膽湯、安神定志丸等為主。

現代醫學研究發現，失眠與γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid，GABA)的代謝異常有明顯的相關性[8]。GABA是中樞神經系統的主要抑制性神經遞質，起著廣泛的抑制調節作用，可引起深慢波睡眠量增加，巴比妥類和苯二氮卓類安眠藥都是基于GABA受體介導的抑制過程發揮作用[9-10]。

元七膠囊是王斌勝教授在中醫理論指導下經過多年的臨床摸索研制而成，該方由三七、元胡兩味藥等比例組成，針對長期的、不明原因的失眠可以有效地改善失眠患者的睡眠持續時間短、入睡困難、睡眠紊亂等，臨床療效確切。但元七膠囊改善失眠的具體作用機制尚不清楚，本文擬進一步探究其作用機制。

1 材料和方法

1.1 實驗動物及主要藥品、試劑和設備 SPF級昆明小鼠150只，雄性，體質量為18～22 g，購買于濟南朋悅實驗動物繁育有限公司，實驗動物生產許可證號為SCXK(魯)20140007。所有動物實驗均按照實驗動物保護原則和濱州醫學院醫學倫理委員會的要求進行。

元胡(批號為160701，北京同仁堂)、三七(批號為20160702，北京同仁堂)，4-氯-DL-苯基丙氨酸(批號為S27337，上海源葉生物科技有限公司)，BCA蛋白濃度測定試劑盒、RIPA裂解液(R0010，索萊寶，北京)，小鼠GABA ELISA試劑盒(ml001894，Mlbio，上海)，兔GABRA1/GABA A受體alpha 1抗體(bs-1232R，Bioss，Beijing)，beta-actin抗體(60009-1-Ig，Proteintech)，羊HRP-結合Affinipure 抗兔IgG抗體(SA00001-2，Proteintech)。

全自動酶標儀(美谷分子儀器，上海)，化學發光成像系統(Clinx，上海)。

1.2 實驗方法

1.2.1 動物造模及分組 將150只昆明小鼠隨機分為5組，每組30只，分別為正常組、模型組、元七膠囊低劑量組、元七膠囊中劑量組和元七膠囊高劑量組。除正常組外，其他4組首先采用以下方法將正常昆明小鼠制備成失眠模型小鼠：將50 mg NaHCO3片劑溶于1 mL蒸餾水，配成 5% NaHCO3水溶液，與0.9%NaCl溶液混合，調整pH值至7～8，加入對氯苯丙氧酸(para-chlorophenylalanine，PCPA)并在混勻儀上充分混勻，使PCPA的濃度為30 mg/mL。每日清晨，按照PCPA 300 mg/kg的劑量腹腔注射PCPA混懸液，連續注射2 d，正常組小鼠注射同等體積的生理鹽水。第一次注射PCPA混懸液36 h后，小鼠出現煩躁不安、飲水增加、進食減少、晝夜節律消失等，提示造模成功。

造模成功后，正常組、模型組給予生理鹽水，元七膠囊低劑量組給予元七膠囊0.39 mg/g，元七膠囊中劑量組給予元七膠囊0.78 mg/g，元七膠囊高劑量組給予元七膠囊1.56 mg/g。每日清晨7∶00—8∶00灌胃，一天一次，連續5 d。

1.2.2 戊巴比妥鈉睡眠實驗 第5天灌胃結束1 h后，各組隨機取6只小鼠腹腔注射戊巴比妥鈉，給藥劑量為0.04 mg/g，觀察并記錄小鼠的睡眠潛伏期和睡眠持續時間。

取材

1.2.3 小鼠血清及腦組織提取 各組小鼠摘眼球采血，將血液收集到2 mL EP管中，離心管中，室溫靜置30 min后，12 000 rpm×30 min離心分離血清，-80℃凍存備用；將小鼠處死后，置于冰面上取腦，同時迅速剝取小鼠腦組織，液氮快速冷凍，放入-80℃冰箱備用。

1.2.4 ELISA檢測 采用雙抗體夾心法檢測小鼠血清中GABA的含量。按照8、4、2、1、0.5、0 μmol/ L的濃度梯度向標準樣品孔加入50 μL不同濃度的標準品，取10 μL待測樣品稀釋5倍后加入樣品孔，向每個標準品孔、樣品孔中加入100 μL酶標試劑后用封板膜將96孔板封好，37℃溫育60 min；用單蒸水稀釋20倍配成的濃縮洗滌液洗滌后向每個孔中加入50 μL顯色劑A溶液，再加入50 μL顯色劑B溶液，在37℃下避光顯色15 min后每孔加入50 μL終止液，反應停止。加入終止液后15 min內，空白孔調零，用酶標儀于450 nm波長處測量各孔吸光度值(OD值)。

1.2.5 Western Blot實驗 稱取一定量的腦組織樣品加入適量裂解液，勻漿后冰上裂解30 min，4℃離心，14 000 rpm×10 min，取上清，待用。按BCA蛋白濃度測定試劑盒說明進行操作，將25 mg/mL蛋白標準品用0.9%Nacl配制成0.5 mg/mL，定容至100 μL，制備標準曲線，使用酶標儀在562 nm波長處檢測吸光值，根據標準曲線計算蛋白濃度。電泳在80 V 30 min和120 V 60 min的條件下進行，轉膜在275 mA 90 min條件下進行。用5%脫脂奶粉室溫封閉2 h。一抗(兔GABRA1/GABA A受體alpha 1抗體，1∶1000)4℃過夜孵育，TBST緩沖液洗滌3次，每次15 min，室溫孵育二抗(1∶1000)2 h，TBST緩沖液洗滌3次，每次15 min，用Alpha Imager 2200儀器采集圖像。

2 結果

2.1 元七膠囊對失眠小鼠的睡眠潛伏期和睡眠時間的影響 與模型組相比，元七膠囊處理各組小鼠的睡眠潛伏期均縮短，P<0.05；同時與模型組相比，元七膠囊處理各組小鼠的睡眠持續時間均延長，P<0.01(圖1)。

圖1 A.元七膠囊可縮短失眠小鼠的睡眠潛伏期；圖1 B. 元七膠囊可延長失眠小鼠的睡眠持續時間。A. 正常組；B. 模型組；C. 低劑量組；D. 中劑量組；E. 高劑量組。與模型組比較，*P<0.05，**P<0.01。圖1 元七膠囊對失眠小鼠的睡眠潛伏期和睡眠持續時間的影響

2.2 元七膠囊對失眠小鼠血清內的GABA含量的影響 使用ELISA法檢測小鼠血清中GABA含量，結果顯示，模型組小鼠血清中GABA的含量低于正常組，P<0.05；低、中劑量元七膠囊治療組小鼠血清中GABA含量較模型組均升高(低劑量組P<0.05，中劑量組P<0.01)；高劑量組小鼠血清中GABA含量也有升高，但差異無統計學意義(圖2)。

A. 正常組；B. 模型組；C. 低劑量組；D. 中劑量組；E. 高劑量組。與模型組比較，*P<0.05，**P<0.01。圖2 元七膠囊對失眠小鼠血清內的GABA含量的影響

2.3 元七膠囊對失眠小鼠的GABA蛋白表達的影響 使用Western Blot檢測小鼠GABA蛋白表達。結果顯示，與正常組相比，模型組小鼠GABA蛋白表達下降；與模型組相比，元七膠囊中、高劑量治療組GABA蛋白表達明顯增加，這提示元七膠囊可能通過促進GABA蛋白的表達來改善模型小鼠的失眠狀況(圖3)。

A. 正常組；B. 模型組；C. 低劑量組；D. 中劑量組；E. 高劑量組。圖3 元七膠囊的失眠小鼠的GABA蛋白表達的影響

3 討論

GABA為抑制性神經遞質，具有鎮靜、抗驚厥的作用，其含量升高可使失眠患者睡眠時間延長，從而提高睡眠質量[11]。而有關GABA神經調節系統的睡眠調節機制非常復雜，GABA受體共有3個亞型，即GABAA、GABAB、GABAC受體，三種受體在受到刺激時具有相似的催眠作用[12]。GABAA受體是一個Cl-孔，具有巴比妥類藥物、苯二氮卓類藥物和神經類固醇的結合位點。而GABAC受體也由包含一個Cl-孔的三部分組成，對GABA的敏感性較GABAA受體和GABAB受體更高，且脫敏過程要慢得多。當受到抑制性神經遞質GABA刺激后，Cl-通道開放頻率增加，導致大量的Cl-內流，引起突觸后膜超極化后抑制神經元放電，減少單胺類神經遞質去甲腎上腺素(NE)的釋放而導致睡眠。

改善失眠藥物的評價通常以戊巴比妥鈉睡眠實驗為主要方法[13]。本研究發現，元七膠囊可以縮短失眠小鼠的睡眠潛伏期并能延長失眠小鼠的睡眠時間，證實了元七膠囊的療效。為進一步探究其作用機制，本研究檢測小鼠血清中GABA的含量發現，低、中劑量組小鼠血清中GABA含量較模型組均升高，高劑量組小鼠血清中GABA含量也有升高，而Western Blot實驗也證實了元七膠囊治療后小鼠腦組織中GABA含量的升高。故本研究認為，元七膠囊改善失眠的機制與調節GABA表達有關。

元七膠囊臨床療效確切，動物實驗也顯示出其良好的效果，但是對其作用機制的研究尚不夠深入，后期將運用蛋白質組學技術探究正常小鼠、失眠小鼠以及元七膠囊治療后小鼠蛋白表達的差異，并對差異蛋白進行深入分析，以探究元七膠囊的作用途徑。