2019-nCoV檢測(cè)方法的研究進(jìn)展

陳立娥 王延飛

濱州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院 山東 濱州 256603

新型冠狀病毒(2019-nCoV)肺炎疫情爆發(fā)以來(lái)，截至2020年6月6日，全球累計(jì)確診病例為6 766 314例，累計(jì)死亡人數(shù)392 449人，與嚴(yán)重急性呼吸綜合征(SARS)和中東呼吸綜合征(MERS)相比，其傳染性更強(qiáng)、傳播速度更快，危害極其嚴(yán)重。

2019-nCoV屬于冠狀病毒亞科β屬，是一種有囊膜的單股正鏈RNA病毒，其基因組長(zhǎng)為29 881堿基，編碼為9 860個(gè)氨基酸，具有4個(gè)結(jié)構(gòu)蛋白，包含12個(gè)蛋白編碼區(qū)/開(kāi)放讀碼框，其中開(kāi)放讀碼框lab(open reading frame lab，ORFlab)、核殼蛋白(nucleocapsid protein，N)基因和囊膜蛋白(envelope protein，E)基因區(qū)域高度保守，因此常被設(shè)計(jì)作為引物和探針的結(jié)合位點(diǎn)[1]。張永振課題組對(duì)其進(jìn)行了病毒分離測(cè)序并公開(kāi)結(jié)果后，各國(guó)對(duì)病毒的研究逐漸深入[2]。面對(duì)新冠病毒感染人數(shù)的逐漸增多，亟需更快、更準(zhǔn)確的新冠病毒檢測(cè)技術(shù)。檢測(cè)技術(shù)中，病毒分離是病毒檢測(cè)的金標(biāo)準(zhǔn)，但其耗時(shí)長(zhǎng)，檢測(cè)難度高，不適用臨床檢測(cè)工作[3]，而CT診斷不適合實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)。根據(jù)目前臨床使用和實(shí)驗(yàn)證據(jù)，對(duì)新冠病毒檢測(cè)的核酸檢測(cè)、免疫檢測(cè)、聯(lián)合檢測(cè)等多種臨床使用和最新實(shí)驗(yàn)室方法進(jìn)行分析總結(jié)，以期對(duì)新冠病毒的防控和人群篩查提供參考。

1 核酸檢測(cè)技術(shù)

1.1 測(cè)序技術(shù) 第二代基因測(cè)序技術(shù)能夠在短時(shí)間內(nèi)實(shí)現(xiàn)高通量的未知基因組測(cè)序。2019-nCoV便是通過(guò)患者的呼吸道分泌物提取病毒RNA，構(gòu)建cDNA文庫(kù)進(jìn)行高通量測(cè)序，隨后進(jìn)行基因組比對(duì)分析，從而確定為一種新型的冠狀病毒。基因測(cè)序的優(yōu)勢(shì)是：能確定未知樣本的序列，這在疫情爆發(fā)初期具有極大價(jià)值；針對(duì)臨床高度疑似但逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(reversetranscription-polymerasechainreaction，RT-PCR)診斷為陰性的病例，使用測(cè)序技術(shù)可以提高準(zhǔn)確性，并判明是否為其他致病病原體；可以檢測(cè)病毒是否變異，以便改進(jìn)檢測(cè)手段。然而測(cè)序技術(shù)的儀器配置要求高，對(duì)檢測(cè)人員的技術(shù)要求高，檢測(cè)時(shí)間長(zhǎng)，費(fèi)用高，不適用于人群大規(guī)模篩查。而納米孔靶向測(cè)序(nanopore target sequencing，NTS)技術(shù)作為一種單分子實(shí)時(shí)的測(cè)序技術(shù)，利用DNA或RNA通過(guò)生物納米孔時(shí)產(chǎn)生的電流變化來(lái)進(jìn)行堿基測(cè)序，且可配合小型實(shí)時(shí)測(cè)序設(shè)備，因此在即時(shí)檢測(cè)(point-of-care testing，POCT)上擁有廣闊的應(yīng)用前景。2月29日，武漢大學(xué)團(tuán)隊(duì)使用NTS技術(shù)實(shí)現(xiàn)了10 min內(nèi)高濃度呼吸道病毒樣品和4 h內(nèi)低濃度樣本的檢測(cè)，靈敏度是實(shí)時(shí)熒光定量PCR的100倍。NTS具有靈敏度高，檢測(cè)范圍廣，成本低，反應(yīng)速度快，且能進(jìn)行突變監(jiān)測(cè)的特點(diǎn)，是其他檢測(cè)方法無(wú)法有效診斷時(shí)最合適的選擇[4]。

1.2 PCR技術(shù)

1.2.1 RT-PCR技術(shù) RT-PCR可以通過(guò)擴(kuò)增病毒的特異性片段來(lái)定性判斷是否感染病毒。其中實(shí)時(shí)熒光RT-PCR作為確診的最常用的診斷標(biāo)準(zhǔn)之一，被選入我國(guó)《新型冠狀病毒的肺炎診療方案(試行第七版)》。實(shí)時(shí)熒光RT-PCR的工作原理是首先將2019-nCoV逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，再利用特異性引物通過(guò)變溫反應(yīng)擴(kuò)增cDNA片段，隨后用熒光信號(hào)檢測(cè)每次PCR循環(huán)產(chǎn)物的總量。利用RT-PCR可以檢測(cè)多種臨床樣品，例如血液、痰液、支氣管肺泡灌洗液、咽鼻拭子、糞便等。RT-PCR具有靈敏、快速、特異性高、適用樣品種類(lèi)多、重復(fù)性好等特點(diǎn)，是較為理想的檢測(cè)方法[5]。首個(gè)檢定合格的新型冠狀病毒檢測(cè)產(chǎn)品是上海之江生物科技股份有限公司的2019-nCoV核酸檢測(cè)試劑盒，該試劑盒能在2 h內(nèi)完成一個(gè)樣品的檢測(cè)，但假陽(yáng)性率較高，隨后陸續(xù)有80多家生物公司開(kāi)發(fā)出RT-PCR試劑盒。然而疫情緊急導(dǎo)致產(chǎn)品研發(fā)上市時(shí)間短，這些檢測(cè)試劑盒的質(zhì)量良莠不齊。從WHO公布的數(shù)據(jù)來(lái)看，根據(jù)2019-nCoV的基因組，已經(jīng)設(shè)計(jì)出針對(duì)其上的ORFlab基因、N基因、RdRP基因、E基因，Spike蛋白，ORF1b-nsp14位點(diǎn)的多種擴(kuò)增序列和探針。同時(shí)一步法RNA檢測(cè)技術(shù)的出現(xiàn)，也讓逆轉(zhuǎn)錄和擴(kuò)增整合于同一個(gè)體系，減少了樣品污染，縮短了檢測(cè)時(shí)間，更適合大規(guī)模批量檢測(cè)[6]。然而，雖然在實(shí)驗(yàn)室中，一步法實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)檢測(cè)2019-nCoV靈敏度能達(dá)到10個(gè)拷貝，但受樣品采集污染，運(yùn)輸不規(guī)范，試劑盒質(zhì)量不一等多種因素，實(shí)際臨床中RT-PCR試劑盒的靈敏度在102拷貝范圍。

1.2.2 數(shù)字PCR 面對(duì)RT-PCR靈敏度低的問(wèn)題，藍(lán)柯團(tuán)隊(duì)開(kāi)發(fā)了微滴式數(shù)字PCR(droplet digital PCR,ddPCR)，將檢測(cè)的下限值降到了RT-PCR的1/500，并且臨床的總體準(zhǔn)確率達(dá)到了94.3%，其極低的檢測(cè)線(xiàn)適用于2019-nCoV早期診斷和臨床治愈的判斷[7]。數(shù)字PCR技術(shù)是一種運(yùn)用泊松分布對(duì)分子直接定量的技術(shù)，其可細(xì)化為微滴式、芯片式、微流控等檢測(cè)分支，但其核心原理是把體系的大量核酸制備成單分子，并在獨(dú)立的反應(yīng)室進(jìn)行擴(kuò)增檢測(cè)，這使其具有高靈敏度，甚至能檢測(cè)單拷貝的病毒樣品。與RT-PCR相比，數(shù)字PCR的檢測(cè)準(zhǔn)確性和靈敏度更高，系統(tǒng)更加穩(wěn)定，重復(fù)性高，可以減少樣本的交叉感染。然而數(shù)字PCR技術(shù)必須配合相應(yīng)的檢測(cè)儀才能使用，導(dǎo)致其成本較高，同時(shí)由于技術(shù)新穎，暫無(wú)國(guó)家或業(yè)界標(biāo)準(zhǔn)，質(zhì)控?zé)o法評(píng)價(jià)，限制了推廣使用。

1.3 等溫?cái)U(kuò)增技術(shù) 恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)既具有PCR的靈敏特異性強(qiáng)的優(yōu)點(diǎn)，又操作簡(jiǎn)單，設(shè)備要求低，肉眼即可確定結(jié)果，是一種適合POCT的快速核酸檢測(cè)技術(shù)。目前最常用的是環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)(loop-mediated isothermal amplification，LAMP)，該技術(shù)的原理是通過(guò)具有鏈置換活性功能的DNA聚合酶，將4對(duì)特異性引物與靶基因的6個(gè)區(qū)域退火雜交，實(shí)現(xiàn)等溫?cái)U(kuò)增，當(dāng)靶基因是RNA時(shí)，通過(guò)添加反轉(zhuǎn)錄酶即可實(shí)現(xiàn)對(duì)RNA的擴(kuò)增[8]。該技術(shù)的效率較高，操作方便，但需注意操作中開(kāi)蓋引起的氣溶膠污染，且其4對(duì)引物對(duì)靶標(biāo)序列的選擇性高，使其應(yīng)用范圍受限。

有團(tuán)隊(duì)報(bào)道運(yùn)用逆轉(zhuǎn)錄LAMP設(shè)計(jì)了6個(gè)引物在65℃恒溫下對(duì)2019-nCoV的ORFlab的8個(gè)不同區(qū)域進(jìn)行擴(kuò)增檢測(cè)，靈敏度達(dá)到了97.6%[9]。中國(guó)疾病預(yù)防控制中心也利用LAMP，與公司合作開(kāi)發(fā)了能在8～15min完成樣品檢測(cè)的試劑盒。2020年2月22日藥監(jiān)局批準(zhǔn)了首個(gè)基于恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)的2019-nCoV檢測(cè)試劑盒，其能1.5 h內(nèi)檢測(cè)16份樣品同時(shí)檢測(cè)6種呼吸道病毒核酸，高效的進(jìn)行人群篩查[10]。

除了LAMP，重組酶聚合擴(kuò)增技術(shù)，滾環(huán)擴(kuò)增技術(shù)，切割酶擴(kuò)增反應(yīng)，指數(shù)擴(kuò)增反應(yīng)等也陸續(xù)發(fā)展出高效能的試劑盒。其中，雅培公司利用等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)開(kāi)發(fā)的2019-nCoV檢測(cè)技術(shù)能在5～13 min得到結(jié)果，即單日能進(jìn)行5萬(wàn)次檢測(cè)，得到了美國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局的應(yīng)急使用授權(quán)認(rèn)證。

1.4 CRISPR技術(shù) 常間回文重復(fù)序列叢集(clustered regularly interspaced short palindromic repeats，CRISPR)系統(tǒng)不僅是基因編輯的利器，更是因?yàn)槠渚哂邪邢騌NA的特性，能夠鑒定是否存在特定序列。同時(shí)它可以與等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)相聯(lián)合使用，提高檢測(cè)準(zhǔn)確度和速度。張鋒團(tuán)隊(duì)基于此開(kāi)發(fā)出SHERLOCK技術(shù)對(duì)樣本處理，核酸擴(kuò)增，靶核酸序列測(cè)定技術(shù)進(jìn)行改造，實(shí)現(xiàn)了常溫下無(wú)需PCR儀和離心機(jī)等設(shè)備，即可測(cè)定下限低至1拷貝的核酸檢測(cè)。SHERLOCK系統(tǒng)采用了HUDSON核酸提取法進(jìn)行核酸提取，隨后利用重組聚合酶擴(kuò)增的方法在兩小時(shí)常溫條件下快速擴(kuò)增靶核酸片段，使用T7 RNA聚合酶將擴(kuò)增的DNA轉(zhuǎn)錄為RNA后，CRISPR/Cas13系統(tǒng)能在crRNA的引導(dǎo)下，利用Cas13a在crRNA互補(bǔ)位置外的側(cè)翼序列附近切割靶RNA，從而將熒光報(bào)告探針切割下來(lái)產(chǎn)生熒光，利用熒光信號(hào)實(shí)現(xiàn)核酸檢測(cè)。同時(shí)靶RNA存在時(shí)，Cas13a會(huì)非特異性的切割體系中的單鏈RNA，因此可以高特異性的檢測(cè)RNA病毒核酸[11]。

本次疫情爆發(fā)后，張峰團(tuán)隊(duì)在2020年2月14日成功實(shí)現(xiàn)基于SHERLOCK技術(shù)，針對(duì)ORFlab和S蛋白基因設(shè)計(jì)了特異性crRNA，開(kāi)發(fā)出一款即時(shí)檢測(cè)產(chǎn)品，該產(chǎn)品便在1 h內(nèi)完成10～100拷貝/μL載量檢測(cè)[12]。其比RT-PCR靈敏度和敏感性更高，檢測(cè)速度更快，應(yīng)用前景廣闊。然而制備高質(zhì)量均一化的Cas13a蛋白的難度較大，且報(bào)道中未到達(dá)SHERLOCK技術(shù)理論檢測(cè)下限，需要進(jìn)一步優(yōu)化。

2 免疫檢測(cè)技術(shù)

根據(jù)WHO的指導(dǎo)意見(jiàn)，血清檢測(cè)應(yīng)該作為核酸檢測(cè)的補(bǔ)充。潛在患者的感染急性期和恢復(fù)期血清中的血清特異抗體免疫球蛋白G(immunoglobulin G，IgG)/免疫球蛋白M(immunoglobulin M，IgM)可以幫助確診。IgM通常于患者感染2019-nCoV后3～5 d出現(xiàn)，濃度與時(shí)間和病毒載量相關(guān)。而18 d后IgG含量明顯上升，其陽(yáng)性表明進(jìn)入感染中后期或既往感染。目前血清學(xué)檢測(cè)試劑盒利用抗原抗體特異性結(jié)合的原理，運(yùn)用了酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)，化學(xué)發(fā)光法，膠體金等技術(shù)。

2.1 ELISA檢測(cè)法 ELISA是一種利用抗原抗體特異性結(jié)合，在聚苯乙烯等固相載體上結(jié)合酶標(biāo)的抗體或抗原，最后利用酶與底物結(jié)合的顯色反應(yīng)，對(duì)待測(cè)抗原或抗體進(jìn)行定量的方法[13]。雖然國(guó)內(nèi)有許多針對(duì)新冠病毒的ELISA試劑盒，然而不同廠(chǎng)家的試劑盒檢測(cè)效果不一。即使ELISA能夠相對(duì)定量的檢測(cè)病毒核酸，但由于ELISA的操作相比化學(xué)發(fā)光法復(fù)雜，手工操作的誤差較大，檢測(cè)時(shí)間更長(zhǎng)，故臨床應(yīng)用較少。

2.2 化學(xué)發(fā)光法 化學(xué)發(fā)光技術(shù)是利用類(lèi)磁粒子包被待檢靶抗原的特異性抗體，并利用吖啶酯類(lèi)等化學(xué)發(fā)光標(biāo)記物作為二抗，通過(guò)激發(fā)液激發(fā)后，檢測(cè)發(fā)光強(qiáng)度，進(jìn)而直接檢測(cè)病毒抗原的方法[14]。特異性抗體主要針對(duì)病毒的表面蛋白或者高度保守的N、S蛋白等。

化學(xué)發(fā)光技術(shù)檢測(cè)試劑盒是臨床一線(xiàn)使用最廣泛的針對(duì)IgM/IgG抗體的試劑盒。例如，重慶醫(yī)科大學(xué)與博奧賽斯公司研發(fā)的試劑盒，對(duì)IgM和IgG抗體靈敏度分別為93.7%和89.6%，特異性分別為96.20%和92.41%，總計(jì)已完成13 532例檢測(cè)[15]。美康公司使用硝酸纖維膜包埋抗體，并將特異性抗體標(biāo)記納米顆粒，運(yùn)用納米顆粒的顯色作用，實(shí)現(xiàn)了對(duì)病毒蛋白進(jìn)行定性檢測(cè)和快速篩查。另有團(tuán)隊(duì)報(bào)道了使用利用合成的S蛋白肽來(lái)檢測(cè)血清中IgG和IgM抗體的方法，這種合成肽的穩(wěn)定性和可重復(fù)性很高，并且比直接使用病毒作為抗原更加具有特異性，臨床診斷陽(yáng)性率能達(dá)到81.5%[16]。

化學(xué)發(fā)光技術(shù)的免疫檢測(cè)試劑盒檢測(cè)快速，并且能實(shí)現(xiàn)高通量和低成本，適用于流行病學(xué)篩查和病程監(jiān)測(cè)，然而其數(shù)據(jù)依賴(lài)高靈敏度的光電倍增管捕獲光子，無(wú)法實(shí)現(xiàn)POCT[17]。

2.3 膠體金免疫層析技術(shù) 膠體金免疫層析技術(shù)是主流的抗體檢測(cè)方法，占抗體檢測(cè)市場(chǎng)的80%。其原理是膠體金顆粒的靜電作用能結(jié)合蛋白質(zhì)分子，將硝酸纖維素膜上包被病毒抗原，利用側(cè)向免疫層析原理捕獲到的膠體金標(biāo)記的IgM和IgG抗體會(huì)與包被抗原形成抗原抗體復(fù)合物，由此實(shí)現(xiàn)信號(hào)放大，在檢測(cè)線(xiàn)處形成紅色反應(yīng)線(xiàn)。

有團(tuán)隊(duì)利用這一技術(shù)開(kāi)發(fā)了定點(diǎn)測(cè)流免疫分析技術(shù)，該技術(shù)能在15 min內(nèi)同時(shí)檢測(cè)臨床血液樣本的IgM和IgG，且監(jiān)測(cè)臨床陽(yáng)性2019-nCoV樣本準(zhǔn)確性能達(dá)到88.66%，特異性為90.63%[18]。

然而膠體金技術(shù)的準(zhǔn)確性和特異性會(huì)受到抗體金標(biāo)記量、加樣量、非特異性吸附、樣品污染、患者自身抗體干擾等限制，這讓膠體金技術(shù)僅能進(jìn)行定性檢測(cè)，且其靈敏性特異性均低于化學(xué)發(fā)光法和RT-PCR技術(shù)。但憑借其操作極其方便，結(jié)果肉眼可見(jiàn)，檢測(cè)時(shí)間短，膠體金技術(shù)在POCT領(lǐng)域廣受歡迎[19]。

3 實(shí)驗(yàn)室聯(lián)合檢測(cè)

在臨床工作中，最常用的RT-PCR方法會(huì)帶來(lái)假陽(yáng)性、假陰性率高，操作繁瑣的問(wèn)題，而免疫檢測(cè)又存在窗口期，容易受患者自身攜帶其他抗體的影響，因此為了提高檢測(cè)的準(zhǔn)確性，一般會(huì)選用多檢測(cè)聯(lián)合的方式。中國(guó)衛(wèi)健委的第七版診療方案中明確指出應(yīng)該使用“核酸+抗體”聯(lián)合的檢測(cè)方案來(lái)彌補(bǔ)單檢測(cè)帶來(lái)的誤診。

除了核酸-抗體聯(lián)合，有證據(jù)表明2019-nCoV感染患者的血常規(guī)，生化免疫等指標(biāo)均有一致的規(guī)律性變化[20]。在發(fā)病早期，患者的白細(xì)胞和淋巴細(xì)胞數(shù)量可能會(huì)減少，這提示了血常規(guī)檢查的重要性。根據(jù)臨床分析，淋巴細(xì)胞亞群分析可能預(yù)測(cè)疾病轉(zhuǎn)歸，且在重癥及危重癥患者中出現(xiàn)淋巴細(xì)胞耗竭現(xiàn)象為100%，對(duì)淋巴細(xì)胞亞群分析可以盡早對(duì)淋巴細(xì)胞耗竭現(xiàn)象進(jìn)行干預(yù)[21]。

4 小結(jié)

檢測(cè)技術(shù)從實(shí)驗(yàn)室到臨床要經(jīng)歷四個(gè)階段：概念認(rèn)證階段、少量樣本分析階段、大量患者參與臨床試驗(yàn)階段和技術(shù)商業(yè)化階段。而疫情爆發(fā)以來(lái)，雖然各式2019-nCoV檢測(cè)方法層出不窮，但大多只停留在第二步少量樣本分析階段，未能真正商業(yè)化運(yùn)用。目前雖然RT-PCR的方式被質(zhì)疑準(zhǔn)確性不佳，但血清免疫學(xué)檢查無(wú)法篩查低病毒載量和無(wú)癥狀感染者，數(shù)字PCR和SHERLOCK技術(shù)雖大大提高了靈敏度卻沒(méi)有行業(yè)運(yùn)用標(biāo)準(zhǔn)。在RT-PCR核酸檢測(cè)試劑盒能及時(shí)滿(mǎn)足臨床需要的情況下，應(yīng)開(kāi)始考慮如何提高2019-nCoV檢測(cè)技術(shù)的靈敏度，準(zhǔn)確性和通量，并爭(zhēng)取能實(shí)現(xiàn)全自動(dòng)流水線(xiàn)式操作或能滿(mǎn)足POCT的要求。