血府逐瘀湯對抑郁模型小鼠行為學及腦內單胺類神經遞質的影響

王永杰，劉廣超，王慧娟，許雪春，張麗娜，李二賢，趙鳳玲

（1.河南省職業病防治研究院，河南省第三人民醫院，河南 鄭州450052； 2.河南中醫藥大學第一附屬醫院，河南 鄭州450000）

抑郁癥是以情緒低落為主要特征的一類心理疾病，主要表現為持久情緒低落、思維遲緩、精力下降、食欲不振、性欲減退、睡眠障礙等［1］。隨著人們生活壓力的增加，抑郁癥的發病率越來越高，已成為威脅人類健康的重大問題［2-4］。該病屬多因素疾病，病因復雜，發病機制涉及生理、心理、社會等多方面，尚未完全明確［5］。臨床上常以藥物、心理、物理等方法綜合治療，雖有一定的緩解作用，但不良反應多，依從性差，易復發。因此，尋找有效的治療方法顯得尤為重要。

中醫學關于情志病的治療歷史悠久，最早見于《山海經》，該書記載了38 種疾病，其中就有“狂”“癡”等記載。此后，在《呂氏春秋》《楚辭》《左傳》《史記》等文獻中亦有情志致病的記載。情志醫學提出于《黃帝內經》，其明確病證名稱，認識病因病機，并注意到躁狂、抑郁、雙向障礙，如《靈樞·癲狂》載“狂始生，先自悲也”；還提出了移精祝由法、情志相勝法、語言開導法等治法。后世醫家在《黃帝內經》認識的基礎上，對抑郁癥有更加深入的研究。抑郁癥屬于“郁癥”“百合病”“臟躁”等范疇［6-8］，以情志所傷、氣機郁滯為主要病因，病機主要是由于氣機紊亂、五臟氣血失調，治療以疏肝理氣、活血化瘀等為主。因此，本研究選用血府逐瘀湯進行研究，該方出自王清任的《醫林改錯》，方由桃紅四物湯合四逆散加桔梗、牛膝而成，具有疏肝理氣、活血化瘀之功效，契合抑郁癥之病機。本實驗以昆明種小鼠為對象，探討血府逐瘀湯對抑郁小鼠行為學及腦內單胺類神經遞質的影響，為血府逐瘀湯在抑郁癥臨床治療中的應用提供依據。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗動物 本研究選用40 只雄性4～6 周齡SPF 昆明種小鼠，體質量（20±4）g，購自河南省實驗動物中心，合格證號：SCXK（豫）2015-0004，飼養于河南中醫藥大學動物實驗中心，飼養于溫度15～26 ℃、相對濕度40%～70%的環境中，并采用自由采食、飲水。

1.1.2 實驗儀器 高速離心機（安徽中科中佳科學儀器有限公司，型號：HC-2064）；小鼠自主活動測試儀（成都泰盟科技有限公司，型號：ZZ-6）；電子恒溫水浴鍋（余姚布亞星儀器儀表有限公司，型號：DZKW-C）；渦旋混勻器（江蘇康健醫療用品有限公司，型號：XH-D）；酶標儀（上海塞默飛世爾儀器有限公司，型號：MULTISKAN FC）；電子秤（上海精天電子儀器有限公司，型號：JT601N）；電子天平（北京賽多利斯科學儀器有限公司，型號：BSA224S）。

1.1.3 藥品與試劑 鹽酸氟西汀膠囊（常州四藥制藥公司，批號：國藥準字H19980139）；5-羥色胺（5-hydroxytryptamine，5-HT）測定試劑盒（北京索萊寶科技有限公司，批號：fk1983Y）；去甲腎上腺素（norepinephrine，NE）測定試劑盒（南京建成生物工程研究所，批號：H096）；多巴胺（dopamine，DA）測定試劑盒（南京建成生物工程研究所，批號：H170）；血府逐瘀湯組方藥材（桃仁、紅花、當歸、生地黃、川芎、赤芍、牛膝、桔梗、柴胡、枳殼、甘草）均購自河南中醫藥大學第一附屬醫院，并經3名中藥師鑒定。

1.2 實驗方法

1.2.1 動物分組 所有40 只大鼠適應性喂養14 d后，隨機分為正常對照組、模型組、血府逐瘀湯組和鹽酸氟西汀組，共4 組。

1.2.2 藥物制備 制備血府逐瘀湯煎劑，藥物由桃仁12 g，紅花9 g，當歸9 g，生地黃9 g，川芎4.5 g，赤芍6 g，牛膝9 g，桔梗4.5 g，柴胡3 g，枳殼6 g，甘草6 g 組成。本研究所有藥物均購自河南中醫藥大學第一附屬醫院，且經3 名中藥師鑒定。所有藥物清洗后，浸泡1 h 后，入鍋，武火燒開后，文火煎40 min，去渣，濃縮成每毫升含1 g 生藥的溶液備用。

1.2.3 造模與給藥 40 只小鼠除正常對照組外，其余30 只小鼠每天選取3～4 個應激因子進行慢性不可預知性刺激（CUMS）。本研究選用的應激因子主要是12 h 禁食、12 h 禁水、12 h 45 °傾斜飼養、夾尾（距尾根1 cm 處夾閉1 min）、光照等，持續3 周，從而建立抑郁癥小鼠模型［9］。中藥給藥劑量根據人鼠換算公式S小鼠/20g=0.0026×S人/70kg，得血府逐瘀湯給藥劑量（口服劑量）為每只小鼠0.2028 g/20 g（成人120 g/70 kg），即每只小鼠10.14 g/kg。血府逐瘀湯組小鼠按10.14 g/kg（含生藥1 g/mL）劑量灌胃血府逐瘀湯，每日2 次，連續14 d。鹽酸氟西汀組小鼠按10 mg/kg 劑量（0.1%的鹽酸氟西汀給藥體積為10.14 mL/kg）灌胃鹽酸氟西汀，每日2 次，連續14 d。按照等量不等濃度的原則，正常對照組和模型組小鼠灌胃等體積蒸餾水，每日2 次，連續14 d。

1.3 行為學觀察

1.3.1 自主活動次數測定 為使實驗小鼠熟悉環境，先將各組小鼠放入自主活動儀10 min，待小鼠適應環境后開始正式實驗。正式實驗是將各組小鼠依次放入自主活動儀內10 min，在5 min 后，開始記錄各組小鼠的水平活動次數、垂直活動次數。

1.3.2 懸尾實驗 各組小鼠給藥結束1 h 后，將小鼠尾端2 cm 的部位貼在一根水平木棍上，使小鼠成倒掛狀態，其頭部離臺面約5 cm，用板隔開相鄰動物的視線。比較各組小鼠在6 min 內累計不動的時間。

1.3.3 強迫游泳實驗 各組小鼠在給藥結束4 d后進行強迫游泳實驗。本研究是將各組小鼠置于水溫25 ℃，水深30 cm 的玻璃燒杯中6 min，觀察6 min 內各組小鼠累計不動時間。不動時間的判定標準：小鼠在燒杯內漂浮在水面，不努力爬出燒杯，僅做一些必須保持其頭部在水面的動作［6］。

1.3.4 大腦海馬區神經遞質含量測定 將各組小鼠頸椎脫臼處死，在冰臺上分離大腦海馬組織，勻漿，3000 r/min 離心20 min，取上清，保存于-20 ℃以下的冰箱。測定各組小鼠腦組織中5-羥色胺（5-HT）、去甲腎上腺素（NE）、多巴胺（DA）含量，嚴格按照試劑盒說明書進行操作。

1.4 統計學方法

采用SPSS 22.0 軟件進行統計分析，計量資料以均數±標準差（±s）表示，采用單因素方差分析（One-Way ANOVA），以P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 各組小鼠自主活動次數測定結果

與正常對照組比較，模型組小鼠水平運動次數、垂直運動次數均顯著降低，差異有統計學意義（P＜0.01）；與模型組比較，血府逐瘀湯組和鹽酸氟西汀組小鼠水平運動次數、垂直運動次數均顯著升高（P＜0.01，P＜0.05），差異有統計學意義。結果見表1。

表1 各組小鼠自主活動次數比較 ±s（次， ）

表1 各組小鼠自主活動次數比較 ±s（次， ）

注：與正常對照組比較，1）P＜0.01；與模型組比較，2）P＜0.05，3）P＜0.01

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2.2 各組小鼠懸尾不動時間、強迫游泳不動時間比較

與正常對照組比較，模型組小鼠懸尾不動時間、強迫游泳不動時間顯著增加（P＜0.01），差異有統計學意義；與模型組比較，血府逐瘀湯組和鹽酸氟西汀組小鼠懸尾不動時間、強迫游泳不動時間顯著降低（P＜0.01），差異有統計學意義。結果見表2。

表2 各組小鼠懸尾不動時間、強迫游泳不動時間比較 ±s

表2 各組小鼠懸尾不動時間、強迫游泳不動時間比較 ±s

注：與正常對照組比較，1）P＜0.01；與模型組比較，2）P＜0.01

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2.3 各組小鼠小鼠海馬組織神經遞質含量測定結果

與正常對照組比較，模型組小鼠5-HT、NE、DA 含量顯著降低（P＜0.05），差異有統計學意義；與模型組比較，血府逐瘀湯組和鹽酸氟西汀組小鼠5-HT、NE、DA 含量升高（P＜0.05），差異有統計學意義。結果見表3。

表3 各組小鼠海馬組織神經遞質含量比較 ±s（ng/mL， ）

表3 各組小鼠海馬組織神經遞質含量比較 ±s（ng/mL， ）

注：與正常對照組比較，1）P＜0.01；與模型組比較，2）P＜0.05

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3 討 論

抑郁癥是一種發病率較高的精神疾病［7］，多由情志改變引起，氣機阻滯為其核心病機，主要表現為心情抑郁、情緒不寧、易怒善哭等，而引起抑郁癥的主要因素是應激刺激［10］。本研究采用12 h 禁食、12 h 禁水、12 h 45 °傾斜飼養、夾尾等多種低強度刺激的方法制備抑郁癥小鼠模型。該造模方法與人類抑郁癥的生物學機制接近，如懸尾和強迫游泳實驗是對抑郁癥患者快感缺乏、興趣缺失、精神運動遲滯等抑郁癥狀進行模擬［11-14］。因此，該方法制備抑郁癥模型，能解釋抑郁癥的顯著異質性，可用于本實驗研究。

目前文獻研究發現，血府逐瘀湯已用于抑郁癥的臨床治療，但實驗室研究較少，其作用機制尚不清楚。本研究結果表明，血府逐瘀湯能明顯增加抑郁小鼠的自主活動次數，并能明顯減少懸尾和強迫游泳不動時間，初步證明該藥有抗抑郁作用。

目前，抑郁癥發病機制的研究較多，如單胺類神經遞質假說、受體假說、腦源性神經營養因子假說等，其中腦內單胺類神經遞質假說得到業內認可［15-17］。該學說認為，抑郁癥主要是由于單胺類神經遞質NE、5-HT、DA 分泌不足所致。因此，抑郁癥治療多以NE、5-HT、DA 為靶點［18-20］，通過增加腦內突觸間隙單胺類神經遞質含量，增強其生理功能來起到抗抑郁的作用。本實驗采用ELISA 法測定了抑郁小鼠腦內海馬組織中NE、5-HT、DA水平，結果表明，血府逐瘀湯能明顯升高抑郁小鼠腦內海馬組織中NE、5-HT、DA 水平，其抗抑郁作用機制與提高小鼠腦內單胺類神經遞質水平相關。

綜上所述，本實驗通過觀察抑郁小鼠自主活動次數、懸尾與強迫游泳不動時間等指標認為血府逐瘀湯具有抗抑郁作用，通過進一步測定小鼠海馬體內單胺類神經遞質（NE、5-HT、DA）水平變化，揭示血府逐瘀湯抗抑郁的作用機制，為臨床應用提供依據。