益腎降濁沖劑對5/6 腎切除模型大鼠腎纖維化及NF－κB 和TGF－β1/Smad3 信號通路的影響

鄭敏麟，傘 勤，劉 廣

（1.福建中醫藥大學中西醫結合學院，福建 福州350122； 2.福建中醫藥大學中西醫結合研究院，福建 福州350122）

慢性腎臟病（chronic kidney disease，CKD）是一種常見的進行性疾病，同時也是世界上死亡率和發病率最高的疾病之一［1］。其中腎臟纖維化是CKD 的主要病理改變［2］，同時也是造成CKD 患者死亡的重要原因之一［3］。慢性腎臟病能夠活化間質成纖維細胞，使其轉化為α－平滑肌肌動蛋白（alpha－smooth muscle actin，α－SMA）陽性的肌成纖維細胞，這些間質的肌成纖維細胞的積累和細胞外基質的沉積會引起腎間質纖維化［4－6］。而上述腎間質成纖維細胞的活化過程，被認為是由生長因子和炎性細胞因子逐漸增加所介導的［7］。現已有許多研究證實了核因子κB（nuclear factor kappa-B，NF-κB）在介導炎癥反應中發揮著其重要的作用，而除了NF-κB 之外，轉化生長因子-β1（transforming growth factor-β1，TGF-β1）也被認為在炎癥反應中發揮著其獨特的作用，TGF-β1可能通過Smad 信號通路發揮其作用。一些細胞因子通過激活TGF-β1/Smad3 信號通路，刺激膠原蛋白基質沉積并促進腎小管間質和腎小球纖維化［8-9］。前期研究已經證實，益腎降濁沖劑能夠改善5/6 腎切除大鼠的腎臟功能，延緩慢性腎衰的進展，且有研究表明，其機制可能與抑制TGF-β1與Smad3信號通路相關［10-11］。在前期研究的基礎上，本研究擬從NF-κB 與TGF-β1/Smad3 雙信號通路角度進一步探討益腎降濁沖劑在慢性腎臟病中的抗纖維化作用，為慢性腎臟病的治療提供新思路。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗動物 SPF 級SD 大鼠72 只，雌雄各半，6 周齡，重量（180～220）g，購自上海史萊克實驗動物中心，實驗動物許可證號：SCXK（滬）2017-0005，合格證編號：20170005005915。飼養于福建中醫藥大學實驗動物中心，溫度（22±2）℃，相對濕度（55±2）%，自由攝食飲水。

1.1.2 藥物與試劑 益腎降濁沖劑由生黃芪30 g，太子參15 g，白術15 g，茯苓15 g，玉竹15 g，當歸15 g，桑椹15 g，桑寄生15 g，懷牛膝15 g，丹參15 g，山楂15 g，陳皮15 g，大黃15 g，六月雪15 g，車前子15 g 組成，由福建省第三人民醫院中藥房提供。大黃素（索萊寶科技有限公司，批號：IE0070）。肌酐測定試劑盒、尿素氮測定試劑盒（長春匯力，批號分別為：A015、B006），Masson 三色染色試劑盒（索萊寶科技有限公司，批號：G1340），白細胞介素1β（IL-1β）、白細胞介素6（IL-6）、腫瘤壞死因子α（TNF-α）ELISA 試劑盒（上海西唐，批號分別為：F15810、F15871、F16960），NF-κB、TGF-β1、Smad3 抗體（Abcam 公司，批號分別為：ab16502，ab215715，ab40854），免疫組化試劑盒（凱基生物，批號：KGOS60）。

1.1.3 實驗儀器 臺式離心機（上海安亭科學儀器廠，型號：Anke，TDL80-2B），酶標儀（美國特寶，型號：Epoch），石蠟切片機（德國萊卡，型號：RM2235），生物組織攤烤片機（湖北孝感亞光醫用電子技術有限公司，型號：YT-7FB），倒置顯微鏡（日本尼康，型號：TS-100F）。

1.2 實驗方法

1.2.1 尿毒癥大鼠模型的建立 手術大鼠以20%烏拉坦麻醉，先切除左腎2/3 腎組織，后于1 周后切除整個右腎，兩次手術共切除腎臟約80%左右。假手術大鼠僅在背部做一切口，暴露腎臟后再縫合傷口。

1.2.2 分組及給藥 72 只大鼠隨機選取12 只進行假手術，其余為60 只進行手術，按以上方法制作尿毒癥大鼠模型。手術完成后，剔除手術失敗和死亡的大鼠，造模成功存活50 只大鼠，將造模成功的大鼠隨機分為模型組，大黃素組，益腎降濁沖劑低、中、高劑量組，另從12 只假手術大鼠中隨機選出10 只作為假手術組，然后根據大鼠劑量是人體6 倍的計算公式，計算出益腎降濁沖劑按照低、中、高劑量（9 g/kg，18 g/kg，36 g/kg）配成水煎劑，大黃素的劑量為500 mg/kg，藥液按1 mL/100 g灌胃量進行灌胃，模型組和假手術組予等體積蒸餾水灌胃，連續用藥8 周。

13 標本收集與檢測方法

治療結束后進行取材，取材前1 晚給予禁食處理，第2 天以20%烏拉坦經腹腔注射麻醉，麻醉完成后，取腹主動脈血用于ELISA 及生化檢測。取血完成后取腎臟，取出腎臟后，用生理鹽水沖洗除去血污及脂肪等組織，放入4%多聚甲醛中用于石蠟包埋。

1.3.1 各組大鼠血清BUN、SCR 含量檢測 將取出的腹主動脈血室溫靜置2 h 以后，將腹主動脈血離心，得到血清，按照試劑盒說明書進行檢測。

1.3.2 各組大鼠外周血中IL-1β、IL-6、TNF-α 含量測定 分別采用大鼠IL-1β、IL-6、TNF-α ELISA 試劑盒檢測外周血中IL-1β、IL-6、TNF-α含量，并參照該試劑盒說明書操作。

1.3.3 腎臟組織Masson 染色 取石蠟塊，切片，二甲苯脫蠟，梯度酒精脫水，Weigert 鐵蘇木素染色液染色5 min，酸性乙醇分化液分化10 s，Masson 藍化液返藍10 min，蒸餾水洗1 min，麗春紅品紅染色液染色3 min，磷鉬酸溶液洗2 min，弱酸工作液洗1 min，直接放入苯胺藍染色液中染色50 s，弱酸工作液洗1 min，酒精脫水，二甲苯透明，中性樹脂封片，后觀察各組大鼠腎臟纖維化情況。

1.3.4 腎臟組織中NF-κB、TGF-β1、Smad3 蛋白檢測 取腎臟組織，石蠟包埋，包埋后切片，二甲苯脫蠟，梯度酒精脫水，脫水后，枸鹽酸微波修復20 min，恢復至室溫之后，滴加過氧化氫室溫孵育15 min，PBS 清洗3 次后，滴加5%羊血清，室溫孵育60 min，然后滴加一抗，4 ℃孵育過夜，第2 天將切片從冰箱中拿出，恢復至室溫后，PBS 清洗3 次，滴加2抗，孵育30 min 后，PBS 清洗3 次，隨后DAB 顯色，顯色后，蘇木素復染細胞核，中性樹脂封片。每組切片選取6 個視野，再采用Image-Pro Plus 6.0分析NF-κB、TGF-β1、Smad3 的表達。

1.4 統計學方法

采用SPSS 22.0 軟件包進行統計學分析，實驗數據以均數±標準差（±s）表示，多組數據分析采用單因素方差分析，P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 各組大鼠血清中BUN、SCR 含量比較

與假手術組比較，模型組血清水平BUN、SCR明顯升高（P＜0.01）；與模型組比較，大黃素組，益腎降濁沖劑高、中、低劑量組大鼠血清BUN、SCR明顯降低（P＜0.05，P＜0.01）。結果見表1。

表1 各組大鼠血清BUN、SCR 含量比較 （±s）

表1 各組大鼠血清BUN、SCR 含量比較 （±s）

注：與假手術組比較，1）P＜0.01；與模型組比較，2）P＜0.05，3）P＜0.01

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2.2 各組大鼠外周血中IL-1β、IL-6、TNF-α 含量比較

與假手術組比較，模型組血清水平IL-1β、IL-6、TNF-α 明顯升高（P＜0.05，P＜0.01）；與模型組比較，大黃素組，益腎降濁沖劑高、中、低劑量組大鼠血清IL-1β 明顯降低（P＜0.05，P＜0.01），益腎降濁沖劑高劑量組IL-6、TNF-α 含量明顯降低。結果見表2。

2.3 各組大鼠腎臟組織Masson 染色比較

Masson 染色結果顯示，假手術組大鼠腎組織只發現少量膠原纖維沉積。模型組大鼠的膠原纖維沉積明顯。益腎降濁沖劑各劑量組膠原沉積情況明顯改善。結果見圖1。

表2 各組大鼠外周血中IL-1β、IL-6、TNF-α 含量的比較（x ±）s

圖1 各組大鼠腎臟組織Masson 染色（400×）

2.4 各組大鼠腎臟組織NF-κB、TGF-β1、Smad3蛋白表達情況

與假手術組比較，模型組大鼠腎臟組織中NF-κB、TGF-β1、Smad3 蛋白表達明顯高于假手術組（P＜0.01）；與模型組比較，益腎降濁沖劑中、高劑量組大鼠腎臟組織中NF-κB、TGF-β1、Smad3蛋白表達明顯降低（P＜0.05，P＜0.01），益腎降濁沖劑低劑量組NF-κB 表達降低（P＜0.05），大黃素組TGF-β1 和Smad3 表達降低（P＜0.05）。結果見表3，圖2～4。

表3 各組大鼠腎臟組織NF-κB、TGF-β1、Smad3 蛋白表達情況 （x ±）s

圖2 各組大鼠腎臟組織中NF-κB 蛋白表達情況（400×）

3 討 論

腎纖維化在慢性腎臟病患者一種常見的病理改變，同時也是CKD 發展終末期腎功能衰竭的主要原因之一。腎纖維化主要病理特征是細胞外基質（ECM）蛋白過度積聚、基底膜增厚，最終導致腎功能損傷，最終引起慢性腎衰竭［11］。

眾所周知，炎癥反應在慢性腎臟病腎病纖維化發展過程中發揮著重要作用［13］，而NF-κB 信號通路被認為是介導腎臟纖維化發展過程中腎臟炎癥的一條重要途徑［14］。當NF-κB 信號通路被激活時，會釋放一系列的促炎癥因子，如IL-1β、IL-6、TNF-α 等，這些炎癥細胞因子通過刺激腎臟從而誘導腎小管上皮細胞表型轉變為間充質細胞進而促使大量ECM 蛋白沉積在腎間質，從而促進腎纖維化形成［15］。孫響波等［16］研究表明，通過抑制NF-κB 信號通路能夠有效地抑制炎癥反應，進而達到抑制腎纖維化的目的。

圖3 各組大鼠腎臟組織中TGF-β1 蛋白表達情況（400×）

圖4 各組大鼠腎臟組織中Smad3 蛋白表達情況（400×）

近年來研究表明，除了NF-κB 信號通路外，TGF-β1也是造成慢性腎臟病腎纖維化的一條重要通路，TGF-β1能夠通過結合I 型和II 型TGF-β受體復合物刺激成纖維細胞的增殖和基質積累，進而激活TβRI 激酶，導致Smad2 和Smad3 磷酸化和激活。一旦被激活，Smad2 和Smad3 通過與Smad4 形成寡聚復合物而轉運到細胞核中［17］，從而誘導ECM 產生最終造成腎纖維化。陶鵬宇等［18］研究表明，當TGF-β1/Samd3 信號通路被抑制時，腎臟纖維化情況能夠得到明顯改善。

中醫藥在我國有著廣泛用于慢性腎臟病治療的歷史，并被公認為現代醫學的有效補充。在中醫文獻中并無關于腎臟纖維化的記載，但根據腎纖維化的形成和發展過程，可將其歸為中醫學中的“癥積”“水腫”“關格”等范疇。脾腎虧虛日久，導致濕毒外邪入侵，造成腎脈絡瘀阻，濕毒瘀在體內相互交結，最終對腎臟造成損傷。而益腎降濁沖劑出自福建省名中醫阮詩瑋，具有健脾益氣、利濕泄濁化瘀的功效，對改善腎纖維化具有明顯輔助效果。本研究以5/6 腎切除誘導的慢性腎臟病大鼠模型為研究對象，觀察益腎降濁沖劑對慢性腎臟病大鼠腎纖維化的治療效果，結果顯示益腎降濁沖劑能夠延緩腎臟纖維化，降低血液中Scr、BUN，表明益腎降濁沖劑具有顯著的腎保護作用。

本研究結果顯示，模型組大鼠血清中炎癥細胞因子IL-1β、IL-6、TNF-α 表達明顯上升，而益腎降濁沖劑各劑量組大鼠血清中IL-1β 表達明顯下降，益腎降濁沖劑高劑量組IL-6、TNF-α 表達明顯下降，提示益腎降濁沖劑能夠降低炎癥相關細胞因子表達，在此基礎上利用免疫組化法進一步對各組大鼠的腎臟中NF-κB、TGF-β1、Smad3蛋白進行檢測，結果顯示模型組腎臟組織中NFκB、TGF-β1、Smad3 蛋白表達升高，而益腎降濁沖劑中、高劑量組NF-κB、TGF-β1、Smad3 蛋白表達下降，表明益腎降濁沖劑能夠抑制炎癥相關細胞因子表達，減輕腎臟纖維化程度，改善腎功能，這可能與抑制NF-κB、TGF-β1、Smad3 蛋白相關。

綜上所述，益腎降濁沖劑可抑制慢性腎臟病的腎纖維化、減輕機體炎癥損傷，其機制可能與抑制NF-κB、TGF-β1、Smad 信號通路有關。