蟲草素的抑菌活性及機理研究

高蘇 馬婕馨 劉警鞠 趙國柱

（北京林業大學生物科學與技術學院，北京 100083）

核苷類抗生素是由核苷和核苷酸衍生而來的一類微生物天然產物，由于核苷和核苷酸在大多數細胞代謝中起著重要的作用，因此核苷類抗生素表現出了廣泛的生物活性［1-2］。目前已經從微生物來源的發酵液中發現了多種核苷化合物，其中的一些核苷化合物如脂西霉素、多毒素等能有效抑制真菌和細菌細胞壁的生物合成，是良好的核苷抑制劑［3-4］。天然產物的生物活性豐富且結構復雜多變，因此從天然產物中篩選開發新型的核苷類抗菌物質是解決菌株耐藥性的一個重要思路。

蟲草素又稱3′-脫氧腺苷，1951年首次從蛹蟲草的發酵液中分離獲得［5］，具有抗菌［6］、抗氧化［7］、抗炎［8］、抗腫瘤［9］、溶血栓降血脂［10］、免疫調節［11］等廣泛的藥理作用。同時蟲草素也是從蟲草中分離得到的第一個核苷類抗菌素，對梭狀芽孢桿菌等細菌表現出了良好的抑菌效果，對其結構進行修飾后能有效抑制炭疽桿菌、鏈球菌、鼻疽桿菌等病原菌的生長［12-13］。在我國蛹蟲草2009年已被批準為新資源食品（2014改為新食品原料）［14］，被廣泛栽培食用，其核心成分蟲草素也被用于開發食品、藥品、保健品等。蟲草素雖被報道具有抗菌作用，但對不同細菌的抗菌譜還不完善，對G+菌及G-菌抑菌效果的差異尚未見報道，抑菌機制缺乏深入研究。本文在前期蛹蟲草液體發酵提取蟲草素的基礎上，以枯草芽孢桿菌等3種常見的G+菌及大腸桿菌等3種常見的G-菌為對象，從抑菌圈、生長曲線、最低抑制濃度、胞內紫外吸收物質泄露和細胞損傷角度，研究蟲草素對其生長影響、抗菌譜、抑菌效果及抑菌機理，旨為蟲草素的深度開發應用奠定理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

供試菌株：蛹蟲草（Cordyceps militaris YCC-W）由中國科學院真菌學國家重點實驗室提供；G+：枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis BS-1）、金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus SA-1）、蘇云金芽孢桿菌（Bacillus thuringiensis BT-1），G-：大腸桿菌（Escherichia coli EC-1）、銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa PA-1）來源于北京林業大學微生物學實驗室；G-：腸沙門氏菌（Salmonella enteritidis SE-1）由中國普通微生物菌種保藏管理中心提供，保藏編號為CGMCC1.10603。

實驗試劑：酵母粉、蛋白胨、氯化鈉、瓊脂粉購自北京易秀博谷生物科技有限公司；磷酸鹽緩沖液、乙酸異戊酯、戊二醛、無水乙醇購自北京藍弋化工產品有限責任公司。

實驗儀器：HZC-250全溫振蕩培養箱（蘇州培英實驗設備有限公司）；752型紫外可見分光光度計（上海舜宇恒平科學儀器有限公司）；SPX-250 生化培養箱（上海龍躍儀器設備有限公司）；冷凍干燥機（北京博醫康實驗儀器有限公司）；LC-20A高效液相色譜儀（島津企業管理（中國）有限公司）；SU-8010場發射掃描電子顯微鏡（日本日立有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 培養基的配制及供試菌株的活化 種子液培養基（g/L）：蔗糖20，蛋白胨20，磷酸二氫鉀1，七水硫酸鎂0.5。

發酵培養基（g/L）：葡萄糖20、魚蛋白胨20、磷酸氫二鉀0.5、七水硫酸鎂0.5、硫酸錳0.5。

LB培養基（g/L）：酵母粉5，胰蛋白胨10，氯化鈉10；固體培養基另補加瓊脂粉16。

PDA培養基（g/L）：葡萄糖20，馬鈴薯200，瓊脂粉16。

菌株的活化：將蛹蟲草菌種接種在PDA培養基上，于21℃生化培養箱中避光培養10 d。用無菌接種環將供試細菌劃線接種到LB斜面試管中，37℃培養24 h。

1.2.2 蟲草素的制備

1.2.2.1 蛹蟲草種子液的制備 從活化菌種中挑取約1 cm2的菌塊接種于裝有100 mL種子液培養基的250 mL三角瓶中，以26℃、130 r/min于培養箱中培養84 h。

1.2.2.2 蛹蟲草發酵液的制備 將種子液以4%接種量接種于液體發酵培養基中，24℃培養25 d，先150 r/min震蕩培養3 d后靜置培養至25 d，過濾收集發酵液。

1.2.2.3 蟲草素的分離純化 將發酵液濃縮后冷凍干燥得凍干粉，加入適量純甲醇充分混勻后4℃過夜，9 500 r/min離心5 min后，減壓濃縮上清液至液體渾濁，加入少量蒸餾水，繼續濃縮至甲醇全部蒸出，于4℃過夜。抽濾后向粗結晶中加入與濃縮后等體積的預冷蒸餾水，混勻后于4℃過夜，再次抽濾并重復操作至沉淀顏色呈白色，將沉淀冷凍干燥即得蟲草素，經HPLC檢測純度為94.26% ± 0.31%。

1.2.3 最低抑菌濃度（minimal inhibitory concentration，MIC）的測定 參照Moreira等［15］的方法并稍作修改。采用二倍稀釋法將高濃度蟲草素溶液進行稀釋，使其在培養基中的終濃度分別為10、5、2.5、1.25、0.625 mg/mL。以無菌的LB培養基作為對照組溶劑，取20 μL處于對數期（105-106CFU/mL）的上述6種供試細菌分別加入到2 mL含有系列濃度蟲草素的LB培養基中，震蕩混勻后37℃恒溫培養24 h，觀察實驗組培養液濁度與對照組濁度無差別即為蟲草素對該細菌的MIC。

1.2.4 抑菌圈（diameter of inhibitory zone，DIZ）的測定 參照Sharma等［16］的方法并稍作修改。取20 μL處于對數期的上述6種供試菌加入到30 mL未凝固的LB培養基中，混勻后倒入無菌培養皿（90 mm）中。待其凝固后，用打孔器在培養基等位置處打4個均勻分布直徑為8 mm的圓孔，向每孔中加入等體積（200 μL）的不同濃度（2.5、5、10 mg/mL）的蟲草素溶液，對照孔加入無菌水，37℃培養24 h后測量記錄抑菌圈直徑。

抑菌圈直徑（mm）= 藥品組抑菌圈直徑-對照組抑菌圈直徑

1.2.5 細菌生長曲線的測定 參照何學文等［17］的方法并稍做修改。將6種供試菌液濃度稀釋到108CFU/mL，分別加入不同劑量的蟲草素并調節其終濃度為2MIC（不受抑制的3種菌中蟲草素的終濃度為10 mg/mL），以不含蟲草素的菌液為對照組，37℃恒溫培養24 h，培養期間每隔2 h取樣，利用752型紫外分光光度計在600 nm處測量光密度值。

1.2.6 細菌胞內紫外吸收物質泄露檢測 參照江琦的方法并稍作修改［18］。將6種對數期供試菌菌液與2MIC蟲草素混勻（不受抑制的3種菌中蟲草素的終濃度為10 mg/mL），以不含蟲草素的菌液作為對照組，37℃培養8 h，期間每隔2 h取樣，8 000 r/min高速離心后收集上清液，用752型紫外分光光度計在260 nm處測量光密度值。為避免蟲草素這一類核苷類化合物對實驗結果產生干擾，本實驗使用含有對應量蟲草素的空白培養基作調零組。

1.2.7 蟲草素對細菌形態的影響 參照Li等［19］的方法并略做修改。將培養至對數期的6種供試菌分別加入含有0、2MIC蟲草素的LB培養基中（3種G-菌中蟲草素的終濃度為10 mg/mL），搖床培養（37℃，150 r/min）4 h后分別取樣2 mL，8 000 r/min離心5 min收集菌體沉淀，PBS洗滌3次后留沉淀。使用2.5%的戊二醛4℃條件下固定12 h，固定結束后依次使用40%、70%、90%、100%乙醇進行梯度洗脫，最后使用乙酸異戊酯置換2次。將處理好的樣品滴于錫箔紙（1× 1 cm），冷凍干燥后于場發射掃描電子顯微鏡下觀察。

1.2.8 數據分析 檢測實驗均重復3次，實驗結果以平均值±標準誤差（Mean ± SD）表示，采用Origin 2019b軟件作圖；采用SPSS 21.0軟件進行數據處理，兩組數據間的比較采用獨立樣本T檢驗進行分析，3組及以上數據間的比較采用（One-way ANOVA）的Duncan法進行多重比較分析，顯著性水平均為0.05。

2 結果

2.1 MIC測定結果

MIC可以定量的反映出蟲草素抑菌能力的強弱，測定結果如表1所示：在供試濃度范圍內，蟲草素對供試G+細菌具有一定的抑菌效果，對供試G-細菌無明顯抑菌效果。其中蟲草素對B. subtilis BS-1的抑制效果最好，MIC為2.5 mg/mL；B. thuringiensis BT-1和S. aureus SA-1對蟲草素的敏感度次之，MIC均為5 mg/mL。

表1 蟲草素MIC測定結果Table1 Determination of cordycepin MIC

2.2 DIZ測定結果

由圖1和表2可知，蟲草素對3種G+菌均具有一定的抑制作用，且抑制效果呈濃度依賴性（P＜0.05），而對3種G-菌無明顯抑制作用。其中B. subtilis BS-1對蟲草素最為敏感，經不同濃度蟲草素處理后測得的DIZ分別為3.6 mm、5.2 mm和8.75 mm，顯著高于同濃度處理的B. thuringiensis BT-1和S. aureus SA-1（P＜0.05）。B. thuringiensis BT-1 和 S.aureus SA-1經2.5 mg/mL蟲草素處理后均無抑菌圈產生，進一步提高濃度后蟲草素對B. thuringiensis BT-1的抑制效果顯著高于S. aureus SA-1（P＜0.05）。該結果與上述MIC的測定結果一致。

圖1 蟲草素對6種供試菌抑菌圈Fig.1 DIZ of cordycepin against six tested strains

表2 蟲草素DIZ測定結果Table 2 Determination of cordycepin DIZ

2.3 供試菌生長曲線測定結果

六種供試菌經蟲草素處理前后生長曲線的測定結果如圖2所示?？煽闯?種供試菌的對照組生長曲線呈典型的S型，可明顯區分出遲緩期、對數期、穩定期，細菌生長狀況良好。在添加2MIC的蟲草素后3種G+菌的生長曲線變化明顯，雖然光密度值也隨著時間的延長而增加，但增加幅度較對照組明顯減小，無法正常進入對數期（P＜0.05）。培養6-12 h后3種G+菌實驗組的光密度值趨于平緩，菌液濃度明顯低于對照組（P＜0.05），蟲草素對3種G+菌的生長起到了明顯的抑制作用。3種G-菌經10 mg/mL蟲草素處理后，整體的生長趨勢及最終菌群密度較對照組無明顯變化（P＞0.05），蟲草素對供試G-菌的整體生長進程無明顯影響。

圖2 蟲草素對6種供試菌生長曲線的影響Fig.2 Effects of cordycepin on the growth curves of six tested strains

2.4 細菌胞內紫外吸收物質泄漏結果

六種供試菌經蟲草素處理后胞內紫外吸收物質泄漏情況見圖3。培養期間6種供試菌的對照組OD260無明顯變化，胞內紫外吸收物質無外泄趨勢，細胞生長狀況良好。3種G+菌經2MIC蟲草素處理后，OD260均在經歷短暫的平穩期后急速增加（P＜0.05），在2-8 h內造成胞內紫外吸收物質不同程度的泄露。部分G-菌如E. coli EC-1經蟲草素處理后胞內紫外吸收物質有輕微泄露趨勢，而S. enteritidis SE-1及P.aeruginosa PA-1在給藥后OD260較對照組無顯著變化（P＞0.05），胞內紫外吸收物質無外泄趨勢。

圖3 蟲草素對6種供試菌胞內紫外吸收物質泄露的影響Fig.3 Effects of cordycepin on the leakage of intracellular ultraviolet absorbents of six tested strains

2.5 蟲草素對6種供試菌菌體形態的影響

利用掃描電鏡觀察6種供試菌經蟲草素處理前后的超微形態結構變化，結果如圖4和圖5所示。當6種供試菌未經蟲草素處理時，正常的菌體呈長桿型或圓球形，菌體大小均一、表面飽滿光滑，細胞結構完整。3種G+菌經2MIC蟲草素處理后，形態較對照組發生了明顯的變化。B. subtilis BS-1經處理后菌體嚴重皺縮不再充盈，表面粗糙、凸起；B.thuringiensis BT-1經處理后菌體干癟皺縮嚴重、部分菌體細胞壁出現斷裂甚至溶解，失去原有的細胞形態。S. aureus SA-1經處理后黏聯現象明顯，菌體腫脹變形、少量細胞解體破碎。3種G-菌經蟲草素處理后也表現出輕微損傷，如E. coli EC-1菌體腫脹變形；部分S. enterica SE-1菌體表面破損、有孔洞出現；部分P. aeruginosa PA-1菌體表面破損脫落，菌體兩端有缺口。

3 討論

核苷類抗生素包括抗細菌、抗真菌和抗病毒等主要類型［2］。蟲草素作為第一個從真菌中分離得到的抗菌核苷類抗生素，其抑菌效果也有所報道。Cunningham等［5］首先探究了蟲草素的抑菌作用，發現其對枯草芽孢桿菌表現出了較好的抑菌效果。相關研究表明蟲草素對大腸桿菌等細菌均有抑菌活性［18，20］。但蟲草素對受體菌的選擇性及作用機理還不夠明確，本研究將供試菌分成G+組和G-組進一步完善蟲草素的抑菌譜，從宏觀生長進程和微觀形態結構角度對蟲草素的抑菌機理進行了初步的探究，為開發蟲草素的生物活性奠定理論基礎。

圖4 場發射掃描電鏡下的供試G+菌形態Fig.4 Morphology of tested G+ bacteria under field emission scanning electron microscope

圖5 場發射掃描電鏡下的供試G-菌形態Fig.5 Morphology of tested G- bacteria under field emission scanning electron microscope

研究結果顯示蟲草素對供試G+菌具有明顯的抑制作用并呈濃度依賴性，而對供試G-菌無明顯抑制作用，表明蟲草素在抑菌方面具有一定的選擇性，但這種選擇專一性并不高，可能受到環境條件的影響及菌株的適應性耐藥性而變化［21］。如江琦［18］和Jiang等［20］發現蟲草素對枯草芽孢桿菌（G+）和大腸桿菌（G-）均有抑制效果，分析可能與菌株耐藥性的差異有關。細胞壁膜系統為細菌提供了天然的保護屏障，受到抗菌物質作用時，壁膜系統受損并喪失功能，胞內大分子物質如DNA、RNA和酶類等會外滲到培養液中，影響細菌正常的生理代謝甚至造成菌體的死亡［22-23］。滲透到胞外的主要是核酸類物質，由于核酸在260 nm處有很強的吸收峰也稱“260 nm物質”，因此OD260被廣泛用作評價細胞完整性的指標［23-26］。經蟲草素處理后，G+菌胞內核酸等物質大量泄露且電鏡觀察結果顯示菌體表面嚴重受損，表明蟲草素能破壞質膜、細胞壁的結構和功能，造成細胞內容物的流失和代謝的紊亂，因此菌體的完整性受損是細菌死亡的原因之一［27］。有研究表明抗菌核苷類抗生素是細菌磷酸-N-乙酰壁氨酰-五肽轉位酶的競爭性抑制劑，通過阻斷肽聚糖生物合成的脂質循環進而阻礙細胞壁的生物合成，這與我們的研究結果相符［2］。蟲草素對3種G-菌的抑制效果較差，這一差異可能與兩類細菌結構組成有關。大多數G+菌如枯草芽孢桿菌和金黃色葡萄球菌都被厚厚的肽聚糖細胞壁所包裹，它對小分子的擴散幾乎沒有阻力。而像大腸桿菌和銅綠假單胞菌這樣的G-菌被額外的脂多糖外膜包圍，它是防止脂溶性抗生素快速滲透的有效屏障［4］。此外，G-菌還具備外排泵，抗菌藥物進入后會被感知并排出，這在一定程度上也增加了G-菌的耐藥性［28］。研究中發現3種G-菌經高濃度蟲草素處理后，部分菌體表面出現了輕微的破損，推測進一步提高蟲草素濃度可能對G-菌也起到一定的抑菌效果，但由于蟲草素在常溫下的溶解度有限［29］，繼續提高濃度后會有不溶性顆粒析出從而影響實驗結果，另外過高濃度的蟲草素也不適用正常的實驗及應用范圍，因此，本研究未對超濃度范圍蟲草素進一步探究。蟲草素作為一種新型的廣譜抗菌素，在食藥保健領域日益引起重視，本研究初步獲得蟲草素對常見細菌的抗菌譜及選擇性，分析了抑菌機理，但其具體的作用靶標和抑菌機理及運用到實際的抗菌治療中還需更深入的研究。

4 結論

本實驗探究了蟲草素對6種常見細菌的抑菌性能，結果表明在溶解度范圍內蟲草素對供試菌的抑菌效果具有選擇性，對3種G+菌有抑制效果，而對供試G-菌抑制效果不明顯。蟲草素能能嚴重破壞供試G+菌的壁膜系統，造成胞內紫外吸收物質的大量流失，影響菌體的正常生命進程。供試G-菌經高濃度蟲草素處理后，部分菌體表面出現輕微破損并伴隨紫外吸收物質的泄露，但細菌的整體生長進程不受影響。