哺乳動物m6A與生長發育相關生物學功能研究進展

薛翔瀾 丁洋洋 劉悅 李曉波 蔣琳 何曉紅 馬月輝 趙倩君

（1. 中國農業科學院北京畜牧獸醫研究所，北京 100193；2. 云南農業大學動物科學技術學院，昆明 650000）

RNA修飾方式眾多，普遍存在于真核生物中，目前已發現100多種修飾方式，這些修飾對RNA功能和遺傳信息多樣性等方面起到重要作用。mRNA的主要修飾方式包括N1-甲基腺嘌呤（N1-methyladenosine，m1A）、5-甲基胞嘧啶（5-methylcytosine，m5C）、N6-甲基腺嘌呤（N6-methyladenosine，m6A）、N7-甲基鳥嘌呤（N7-methylguanosine，m7G）和假尿嘧啶（pseudouridine）等。其中m6A作為真核信使RNA（Messenger RNA，mRNAs）中最豐富的修飾，在許多生物過程中發揮重要作用。此外，m6A在轉運RNA（transfer RNA，tRNA）、核糖體RNA（ribosome RNA、rRNA）中也具有一定的作用，具有多種生物調節功能。多項研究表明，m6A參與RNA的剪接、轉錄、加工、出核轉運、翻譯、降解，對胚胎發育、脂肪生成、肌肉發育和疾病等生物學過程具有重要作用［1-2］。

20世紀中期，在細菌DNA研究過程中首次發現m6A，20世紀60年代通過RNA大腸桿菌實驗首次分離出m6A，并在細菌、小鼠、兔子、小麥、病毒等中相繼檢測出m6A［3-6］。20世紀70年代科研人員利用發現的真核生物Poly（A）結構研究RNA甲基化在癌細胞中的情況顯示，堿基和核糖中均存在甲基化，且甲基化程度均較高［7］。20世紀90年代，研究發現m6A的堿基修飾參與調控細胞周期，后因缺乏對mRNA上單個m6A修飾位點的鑒定方法，m6A少有研究。近年，隨著高通量測序技術的發展，使m6A修飾位點的鑒定得以實現［8］，m6A重新進入科學家們的視野中，m6A甲基化修飾調控及生物學作用成為新的遺傳學研究熱點。多位研究人員通過高通量測序等技術鑒定人和小鼠等生物全基因組水平m6A甲基化調控位點，并聯合其他組學數據及通過功能驗證揭示m6A修飾對基因表達及生物學過程的調控機制（圖 1）［9］。

1 m6A甲基化修飾酶及研究方法

1.1 m6A甲基化修飾酶

m6A 甲基化作為普遍存在于真核細胞生物的信使 RNA（messenger RNA，mRNA）轉錄后修飾［11］，在多數真核生物中具有高度保守性。通常m6A 修飾包含在共有序列5′-RRACU-3′（R=A或G）中，并且主要結合位點在翻譯終止密碼子附近蛋白質編碼區（sequence coding for aminoacids in protein，CDS）及 3′UTR 端［12］。m6A 作為堿基 A 第六位 N 原子上以活性腺苷胺酸為甲基供體發生的RNA 甲基化修飾，其mRNA 修飾的過程復雜多樣，主要是通過甲基轉移酶復合體（METTL14，METTL3 和WTAP組成）、去甲基酶（ALKBH5和FTO）和RNA結合蛋白（YTH家族）共同合作修飾［13-15］。

圖1 mRNA m6A甲基化修飾主要研究進程［10］Fig.1 Main research process of m6A methylation modification across mRNA

Writers（書寫器）作為m6A甲基轉移酶，催化RNA中腺苷酸上m6A甲基化修飾，促使m6A甲基化基團寫入RNA。甲基轉移酶主要包括甲基轉移酶樣3（methyltransferase like 3，METTL3）、甲基轉移酶樣 14（methyltransferase like 14，METTL14）、Wilms腫瘤抑制因子-1-相關蛋白（wilms tumor 1-associating protein，WTAP）和 KIAA1492［16-17］。甲基化修飾蛋白間會形成復合物共同行使催化功能，METTL3 和METTL14之間形成復合物，其中METTL3具有催化活性的亞基，而METTL14在底物識別上具有重要作用，作為m6A甲基轉移酶多蛋白復合物的主要催化成分，兩者缺失可導致m6A幾乎完全缺失。也有學者對METTL14作為甲基化酶提出不同的觀點，研究發現METTL14沒有結合S-腺苷甲硫氨酸（S adenosyl L methionine，SAM）的結構域，不能單獨行使m6A甲基化酶的功能，其只能通過與METTL3結合影響m6A水平［18］。WTAP引導和定位METTL3-METTL14復合物進入核斑點，從而有效甲基化目標RNA［17］，敲除 WTAP 導致 METTL3和 METTL14的降解并顯著降低了m6A的水平［12］。小鼠胚胎成纖維細胞檢測甲基化位點的結果顯示多數甲基化位點依賴于WTAP 修飾，證明WTAP是mRNA m6A甲基化必不可少的甲基轉移酶［19］。

Erasers（擦除器）又稱m6A去甲基酶，主要對RNA中的m6A甲基化基團進行去甲基化修飾，包含肥胖相關蛋白（fat mass and obesity associated，FTO）、Alk B同 源 蛋 白 5（alk B homolog5，ALKBH5）以及其他同源基因［20］。FTO和ALKBH5均屬于FeII/α-KG依賴性雙加氧酶ALKB家族，2007年3個獨立實驗室分別證實當FTO基因產生突變時會增加肥胖風險［21-23］。FTO可在體外與單鏈DNA（single-stranded DNA，ssDNA）和單鏈 RNA（single-stranded RNA，ssRNA）中多個去甲基酶活生理底物結合氧化脫甲基［24］。

Readers（閱讀器）編碼基因被稱為識別蛋白，識別蛋白會與 RNA上的m6A甲基化位點結合進而執行各種生物學功能［25］。主要包括YTH家族（YTHDF1、YTHDF2、YTHDF3、YTHDC1 和 YTHDC2）［26-27］、eIF3、hnRNPC 和 hnRNP A2/B1［28-29］以 及其 他 同源性基因。已有研究對YTH結構域家族蛋白進行定位發現，YTHDFs型蛋白主要存在于識細胞質中，而YTHDCs型蛋白則主要在細胞核內發揮作用［27，30-31］。研究發現 YTHDF1和 YTHDF3蛋白參與調控mRNA的翻譯效率，同時YTHDC1蛋白對編碼和非編碼基因的轉錄均有調控作用。

甲基轉移酶和去甲基化酶主要作用于基因表達修飾，去甲基化酶的存在進一步證實了m6A甲基化修飾RNA與DNA表觀遺傳修飾一樣也具有動態可逆的修飾過程。該機制可由甲基轉移酶復合物MTTL3-METTL14-WTAP建立且對腺苷酸進行修飾，同時又可被FTO、ALKBH5這類去除酶移除（圖2）。

1.2 m6A檢測方法

常見甲基化位點檢測方法包括：比色法［32］、高通量測序法MeRIP-Seq（methylated RNA immunoprecipitation sequencing） 又 稱 為 m6A-Seq（m6A-specific methylated RNA immunoprecipitation sequencing）［33-34］、三重四級桿質譜聯用技術（HPLC-LC/MS/MS）［35］、紫外交聯免疫共沉淀技術，具體包括光交聯輔助m6A測序技術（photo-crosslinking-assisted m6A sequencing strategy，PA-m6A-Seq）、m6A堿基分辨率交聯共沉淀技術（m6A individual-nucleotide-resolution cross-linking and immunoprecipitation，m6A-miCLIP，或 稱 為 UV-CLIP） 和 m6A-LAIC-Seq［36］、m6A-REFSeq（表 1）。

圖2 m6A甲基化的調節過程Fig.2 The regulation process of the m6A

早期受實驗規模的限制，針對N6-甲基腺苷的研究主要利用在mRNA中m6A出現在特定序列GAC（70%）或AAC（30%）［37-38］中這一特點，采用同位素標記法［39-41］、薄層色譜［42］對 m6A 進行定位檢測。隨著二代測序技術和質譜等技術的發展，研究發現高效液相色譜可提高定量m6A的精確性并監測其動態狀態［13］，抗體免疫印跡方法（dot-blot）同樣可以精確檢測m6A的含量。此外，基于免疫沉淀法識別N6-甲基腺苷位點的MeRIP-Seq高通量測序技術陸續被應用［43］。

2019年兩個研究團隊同年利用MazF酶對m6A修飾的特異性識別特點，分別開發新型m6A位點鑒定方法：m6A-REF-seq法和MAZTER-seq法。這兩種方法原理基本一致，不僅可以從頭檢測m6A位點，對甲基化進行定量，還可以對亞細胞、不同類型細胞等的m6A進行定量。駱觀正研究團隊的m6A-REF-seq方法側重研究m6A修飾位點定性的準確性，而Schwartz團隊的MAZTER-seq推動m6A研究進入定量領域［44-45］。

表1 m6A甲基化檢測手段Table 1 Detection method of m6A methylation

2 m6A與動物生長發育

2.1 胚胎發育

2014年Batista等［47］發現核心多能性轉錄因子的RNA在小鼠和人類胚胎干細胞（embryonic stem cells，ESCs）中具有m6A修飾，Xiao等［48］利用MeRIP-Seq測序方法首次繪制了人類胎兒組織的m6A圖譜，同時發現m6A位點存在大量已知人類表達定量性狀基因座（expression quantitative trait loci，eQTL）和單核苷酸多態性（single nucleotide polymorphisms，SNP），推測這些SNP參與調控m6A修飾。不同組織lincRNA的m6A修飾分析發現增強子RNA（enhancer RNAs，e-lincRNA）區域m6A顯著富集，結果表明m6A可能與增強子RNA功能有關；并發現METTL3在高CpG基因的轉錄起始區富集，這暗示m6A可能通過共轉錄的方式，直接調控相應基因的表觀狀態和轉錄。該研究揭示m6A在人類組織發育和穩態調控中的潛在功能。m6A對胚胎干細胞的多能性和分化具有重要影響，在ESCs中m6A可影響mRNA代謝、維持細胞自我更新并調控胚胎細胞分化［49］。為探究m6A對小鼠胚胎發育的影響，研究敲除成骨細胞和原始態胚胎干細胞中的METTL3，結果顯示胚胎整體m6A甲基化水平降低，缺乏METTL3的這些細胞能夠存活，但無法完全終結原始態多能性［50］。在小鼠ESC中敲低METTL3和METTL14抑制多能性基因SOX2，NANOG和DPPA3的表達，并促進了小鼠ESC中發育調節因子FGF5，CDX2和 SOX17的表達［16］。多項研究表明小鼠ESCs中m6A 對干細胞分化節律具有調控作用，它保證了多能性因子下調的準確性和及時性，為細胞分化和ESCs譜系成熟提供保障。

小鼠體內識別蛋白YTHDF2的耗竭會導致胚胎發育后期死亡，結合體內和體外比對YTHDF2缺失的小鼠胚胎和正常小鼠胚胎，在YTHDF2缺失的小鼠胚胎中神經干細胞（NSPCs）的增殖和分化能力明顯下降，且神經元不能產生正常功能的神經突，研究證明YTHDF2參與mRNA降解最終調節神經發育［51］。在小鼠睪丸中，使用Vasa -Cre系介導敲除小鼠早期生殖細胞中METTL3或METTL14基因，結果顯示敲除小鼠隨著年齡的增長，二倍體精原干細胞（spermatogonial stem cells，SSC）逐漸減少［52］，Xu等［53］敲除雄性小鼠中METTL3，在生殖細胞中METTL3失活抑制精原細胞分化、阻礙減數分裂，m6A對哺乳動物精子發生與繁殖中具有調控作用。

2.2 m6A與脂肪生成

m6A作為RNA主要修飾方式，不同m6A甲基化修飾在脂肪生成中具有不同調控作用。m6A甲基化基因糖基磷脂酰肌醇高密度脂蛋白結合蛋白1（glycosylphosphatidylinositol anchored high density lipoprotein binding protein 1，GPIHBPI）基因作為脂蛋白脂酶（Lipoprotein Lipase，LPL）的載體及重要調控因子，GPIHPI在脂肪組織中轉錄水平較高，能夠與LPL基因結合形成脂解平臺并參與毛細血管內皮細胞中LPL 基因轉運。高脂飲食試驗中對正常飲食和高脂飲食（high-fat diet，HFD）誘導的小鼠肝臟進行MeRIP-seq分析，發現HFD肝臟中上調甲基化的編碼基因主要富集于脂代謝相關的過程，從而調節肝臟脂質代謝［54］。Zhao等［55］對脂肪含量差異顯著的長白豬和金華豬背部脂肪組織m6A 甲基化進行分析發現，長白豬脂肪組織中m6A含量顯著高于金華豬，過表達YTHDF1增加PNPLA2表達并促進脂肪生成，其中PNPLA2（Patatin-like phospholipase domain containing 2）是促進脂肪生成特異性表達基因［56］。在脂肪細胞中進行同義突變（synonymous mutations，MUT）以降低差異解偶聯蛋白 2（uncouplingprotein 2，UCP2）和PNPLA2 mRNA的m6A水平。成脂試驗及m6A檢測表明m6A負調控UCP2蛋白表達，正調控PNPLA2蛋白表達。通過過表達YTHDF1和YTHDF2檢測相關基因變化，證實m6A修飾可通過YTHDF1影響PNPLA2的翻譯，而m6A修飾UCP2途徑尚未得知。研究顯示YTHDF2也參與脂肪生成調控；在前體脂肪細胞中，YTHDF2通過靶向識別、捕獲由m6A去甲基化酶沉默導致具有較高m6A修飾水平的Atg5和Atg7轉錄本并使其降解，進而抑制脂肪生成。同時發現在小鼠的脂肪組織中特異性敲除FTO導致白色脂肪沉積顯著降低及靶向因子Atg5和Atg7表達下降，從而證實FTO抑制脂肪生成［57］。

m6A對骨骼間充質干細胞具有特異性調控功能，敲低骨髓間充質干細胞（bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs）中METTL3會導致骨形成受損，成骨分化潛能不足以及骨髓脂肪增多［58］。高脂飲食孕鼠后代mRNA m6A水平顯著上調，脂肪含量下調，METTL3表達量顯著上調，這表明母體攝入高脂可以以組織特異性和發育依賴性的方式影響后代mRNA m6A修飾及其相關基因的表達，進而調控脂肪生成，并為m6A系統從母體營養向后代食物的傳播提供可行性［59］。在敲低小鼠胰島B細胞METTL14（βKO）研究中發現，HFD的βKO孕鼠新生胎兒脂肪生成減少，肝臟脂肪分解增加，敲低METTL14減少HFD喂養導致代償性胰島素B細胞增加，糖尿病風險上升［60］。

2.3 m6A參與肌肉發育

肌肉是動物機體重要的組成部分，其生長發育過程受多種轉錄因子調控和表觀遺傳調控等。近期多項研究表明m6A參與骨骼肌成肌分化、心肌重塑、再生等。METTL3在骨骼肌肌肉分化中具有正向調控作用，同時METTL3 能維持成肌細胞中MyoD mRNA穩定。在肌源干細胞中MyoD表達量受到m6A 修飾調節，敲低METTL3導致MyoD 特異性下調［61］。通過m6A 測序分析顯示：在成肌細胞增殖過程中METTL3 通過位于MyoD的5′UTR的m6A修飾來調節MyoD的表達。過表達METTL3可提高m6A甲基化水平以促進成肌細胞成肌分化，通過外源甲基化抑制劑環亮氨酸（cycloleucine，Cyc）和甲基供體甜菜堿（betaine，Bet）研究m6A甲基化對小鼠成肌分化的調節作用發現，METTL3和Bet正向調控m6A甲基化水平，而Cyc負調控m6A甲基化水平，推測m6A甲基化正調控成肌分化［62］。受孕小鼠高脂攝入影響其雄性后代小鼠骨骼肌m6A修飾，進而調控肌肉生長，對不同周齡小鼠后代脛骨前肌中m6A表達水平檢測，結果顯示m6A表達量先升高后降低，同時檢測不同時期肌肉中FTO表達量，進一步說明肌肉中m6A表達量干擾受孕小鼠肌肉生長［59］。Wang等［63］通過研究FTO對小鼠骨骼肌肌肉分化的影響，首次證明FTO參與調控肌源性干細胞分化。

Mathiyalagan等［64］研究了常氧和低氧狀態下體外心肌細胞中FTO表達量與心肌收縮功能的關系，表明FTO在體外減緩缺氧誘導的心肌細胞功能障礙，且證實在小鼠體內過表達FTO導致RNA m6A下調可改善心衰誘導的心功能障礙，FTO在未來的心衰竭治療中具有潛在的作用。多個研究通過構建不同小鼠心臟模型（功能完好和功能缺失）評估m6A METTL3途徑在心臟穩態和功能方面的作用，結果顯示過表達METTL3會誘發心肌肥大，同時METTL3介導的m6A 甲基化對心力衰竭等具有拮抗作用［65-66］。m6A修飾RNA同樣存在于血管平滑肌細胞（vascular smooth muscle cell，VSMC）增殖分化過程中，m6A修飾蛋白通過調控相關基因表達進而影響VSMC 的增殖。對三七總皂苷（total panax notoginseng saponin，TPNS）抑制內膜增生并抑制肌肉損傷后VSMC的增殖研究發現，TPNS通過促進WTAP的表達，可負調控VSMC的活力從而影響其增殖能力［3，67］。脂肪干細胞（adipose-derived stem cell，ADSC）可分化為平滑肌細胞，在誘導ADSC誘導分化成血管平滑肌的過程中METTL3表達量上調，低氧應激介導METTL3的表達可促進ADSC分化為 VMSC［67］。

3 展望

目前，對m6A的研究在人和模式動物相關RNA表觀遺傳學調控功能探究水平上已取得了一定的進展，但對m6A修飾與哺乳動物生長發育調控機制的研究剛剛起步，未來仍然有許多科學問題亟待探究。除了目前已鑒定的哺乳動物m6A相關修飾酶外，是否還有其它m6A的甲基化酶、去甲基化酶和識別蛋白參與m6A修飾，其對于mRNA表達及蛋白翻譯又有何調控作用。關于m6A功能的研究大多通過對甲基化酶和去甲基化酶修飾完成，但是參與m6A下游區域功能調控酶有哪些，且這些酶是僅僅作用于RNA上的m6A修飾，還是存在其它修飾底物，我們不得而知。此外，對m6A受何種調控知之甚少，非編碼RNA、DNA甲基化等如何影響m6A修飾有待進一步研究。未來，隨著研究的不斷深入及m6A甲基化檢測技術的不斷完善，綜合應用基因組學、蛋白組學、生物信息學、基因編輯等多層次技術手段，相信對m6A在胚胎發育、細胞分化、生長發育、疾病發生發展等方面的功能及調控機制會有更為系統深入的了解。