細菌素的研究與應用進展

田露 吳咪 緱敬軒 龔國利

（陜西科技大學食品與生物工程學院，西安 710021）

食源性病原體是影響食品質量的重要因素，威脅著人類的身體健康，甚至造成致命的影響［1］。例如，單核細胞增生李斯特菌、腸球菌、鏈球菌、葡萄球菌、芽孢桿菌和大腸桿菌等病原體進入人體組織后，會引起呼吸道感染、全身感染和腸道感染及癌癥等疾病。因此，在食品中添加化學防腐劑或天然防腐劑是必不可少的。

天然防腐劑，主要是由微生物分泌的次生代謝產物或體內存在的具有抗菌作用的物質。在微生物中，乳酸菌（lactic acid bacteria，LAB）可產生一系列活性抗菌物質（有機酸、過氧化氫或細菌素）［2］，其中細菌素因高抑菌、低毒性等特點而具有較強的生物保存潛力。

細菌素是由核糖體合成的具有20-60個氨基酸長度的分泌抗菌肽（antimicrobial peptides，AMPs），具有疏水性，能抑制革蘭氏陰性和革蘭氏陽性食品致病菌，因此提供了新的策略與病原菌作戰［3］。其中，LAB產生的乳酸鏈球菌（Nisin）已被食品藥品管理局授予“一般認為安全”（generally recognized as safe，GRAS）的安全性指標［4］。Nisin被發現能抑制奶酪和其他食物中肉毒桿菌孢子的萌發。乳酸桿菌產生的Pediocin PA-1，具有延長多種即食產品貨架期的潛力，特別是抑制單核細胞增生李斯特菌的生長［5］。

細菌素對其產生菌也有毒性，但通過一系列免疫蛋白，它們可以進行自我保護［6］。編碼細菌素、免疫蛋白和其他輔助蛋白的基因排列成操縱子，這些操縱子存在于基因組、質粒或其他可移動的基因元件中。一般來說，這些操縱子是可誘導的，需要分泌和細胞外積累的肽誘導［7］。

微生物對細菌素的敏感性是由于細菌素與細菌細胞表面和細胞膜的相互作用所致。細胞膜通透性和孔隙形成是細菌素攻擊靶細菌的主要機制［8］。然而，一些食物致病菌對Nisin和Pediocin等細菌素產生耐藥性的報道表明，耐藥性的增加可能會損害細菌素在生物保存中的潛在作用［9］。因此，為解決細菌素耐藥性問題，需進一步了解細菌素的功能及其降解機理。

由于細菌細胞膜表面電荷和膜流動性是細菌素在抑菌過程中所利用的兩個特性，對這些特性的操縱會使細菌素無效，從而導致細菌素耐藥性［8］。然而，許多研究表明，不同細菌素組合使用或與其他抗菌化合物組合使用可克服細菌素的耐藥性。由于細菌素是由核糖體合成的抗菌肽，因此通過生物工程技術改造特定的氨基酸殘基能夠使其更有效地抵抗食品腐敗菌［9］。本文綜述了細菌素的分類、合成和抑菌機理以及生產方法，介紹了細菌對細菌素產生抗性的機制以及減輕細菌素耐藥性的方法，進一步闡明了細菌素在食品保鮮中作為天然防腐劑的潛在應用。

1 細菌素的分類

細菌素最初被分為I、II、III和IV四類。其中I類細菌素包含19-50個氨基酸，如羊毛硫氨酸、N-甲基羊毛硫氨酸、脫氫酪氨酸和脫氫丙氨酸等非編碼氨基酸［10］。I類細菌素可進一步劃分為Ia類（Lantibiotics）、Ib類（Labyrinthopeptins）和Ic類（Sanctibiotics）。

II類細菌素是一類具有熱穩定性、未經修飾的小肽，可進一步劃分為IIa類（類片球菌素）、IIb類（兩肽未修飾的細菌素）、IIc類（環狀細菌素）和IId類（未修飾的、線性的和非類片菌素）［11］。其中較為典型的Bactofencin A是一種具有某些特殊功能的新型IId細菌素，它與某些真核生物的陽離子抗菌肽相似，具有高度陽離子化的特征［12］。此外，Bactofencin A的另一個獨特之處在于，它與特異性免疫蛋白不同，它表現出dltB同源物介導的免疫功能，可降低細胞壁的負電荷，從而阻礙細菌素與細胞之間的相互作用［12］。

III類細菌素是一類分子量大且熱不穩定的細菌素。如大腸桿菌產生的大腸桿菌素，彎曲乳桿菌、益生乳酸菌和糞腸球菌產生的Helveticin M、Helveticin J和 Enterolysin A［13］。其中 Helveticin M 可破壞革蘭氏陽性菌的細胞壁和革蘭氏陰性菌的外膜，因此對革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌均有效。

IV類細菌素由碳水化合物或脂質成分的大復合物組成，已被終止并被命名為由溶菌素S和Nisin 27組成的溶菌素［14］。因此，細菌素主要分為以上3類。具體分類及屬性，見表1。

2 細菌素的合成及其抑菌機理

產生活性細菌素的基因通常在操縱子簇中，存在于基因組，質粒或其他可移動的遺傳元件中。這些操縱子的表達是可誘導的，需要自誘導肽的誘導［23］。細菌素的表達通常受兩組分系統調控，但在某些情況下受三組分系統調控。Nisin是通過激活兩組分調控系統而充當其表達的自誘導劑。但是，某些細菌素例外，它們具有自己獨特的調節與表達方式。例如，LsbB細菌素，位于lsbB基因下游的轉錄終止子，通過將RNA穩定性提高3倍來調節其表達，從而使表達增加30倍［23］。有研究表明，細菌素Brevicin 174A的產生和自我抗性受兩種轉錄調節蛋白的控制，它們在其中充當積極的自我調節作用［7］。

細菌素是作為前體肽合成的，但前體肽不具備生物活性，需經過加工、翻譯修飾和轉運后才能形成成熟的細菌素［24］。用于修飾和輸出的基因位于細菌素生物合成基因附近。細菌素的類型不同，修飾可能會有所不同。像ABC轉運蛋白和Sec依賴性蛋白這樣的轉運蛋白用于細菌素的分泌［25］。

表1 細菌素的分類及屬性Table 1 Classification and properties of bacteriocins

不同種類的細菌素對革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌有不同的作用機制。由于大多數細菌素是陽離子型的，因此細菌素分子與細菌表面陰離子成分之間的相互作用在細菌素產生活性的初始階段起著至關重要的作用。細菌素采取構型，以使帶正電的基團與帶負電的細菌表面發生靜電相互作用，而疏水性表面朝向膜排列并穿過脂質雙分子層，刺入脂質雙分子層后，肽段自締合或聚合形成復合物［26］。細菌素誘導靶細菌細胞膜通透性，可能是通過形成離子選擇性孔而引起的。這些孔會導致鉀、鎂、磷離子、氨基酸和ATP等小分子的流出，從而引起膜電位的擾動，pH梯度和質子泵的功能受到抑制。細胞中低水平的ATP和離子缺乏會導致DNA、RNA、蛋白質和多糖合成受到抑制，最終導致細菌細胞死亡［27］。

細菌素需磷酸轉移酶系統對接分子（如脂質II或甘露糖滲透酶）與膜相互作用。也存在某些細菌素可能不需要靶受體進行對接。Garvicin ML，來源于乳球菌DCC43的環狀細菌素，利用麥芽糖ABC轉運蛋白和滲透酶作為受體［28］。對接分子可增強羊毛硫細菌素孔的傳導性和穩定性，但目標膜中的受體可能決定II類細菌素的特異性［8］。I類細菌素是帶有羊毛硫氨酸殘基的羊毛硫細菌素，形成分子內硫醚環［29］。II類細菌素很小，具有窄譜的抑菌活性。羊毛硫細菌素在“楔形”模型中形成孔，而II類細菌素通過“桶壁”孔或“地毯”機制增加膜通透性［8］。

3 細菌素的生產方法

研究表明，細菌素主要是通過菌株的發酵生產。由于微生物發酵法產生的細菌素產量低且純化繁瑣。因此開發了固相肽化學合成法（solid phase peptide chemical synthesis，SPPS）和異源表達法生產細菌素。

3.1 發酵法

在含有乳清粉（5% W/W）和酵母提取物（0.2%W/W）的培養基中，用乳酸乳球菌ATCC發酵生產Nisin。將種子培養物（2.5% W/W）接種到發酵液中，一旦乳酸濃度達到25 g/L，停止發酵并將溫度升高至50℃，以停止細菌的生物活性。所獲得的Nisin濃度為3 000 IU/mL，蒸發發酵液以得到濃縮的Nisin［30］。

細菌素的產量取決于發酵培養基的組成，發酵培養基約占生產成本的30%。多種低分子復雜介質使蛋白質純化變得更加繁瑣，從而增加了生產成本［31］。對反應動力學，發酵過程建模以及用便宜培養基代替昂貴培養基的研究將是促進細菌素生產和應用的重中之重。

3.2 化學合成法

由于微生物發酵法產生的細菌素產量低，純化繁瑣，因此開發了SPPS生產細菌素。用于合成肽的試劑和構建基元的價格降低，以及催化天然蛋白翻譯和修飾的化學進步，使化學合成法成為生物醫學應用中的一種替代方法。

細菌素AS-48是由70個氨基酸組成的環狀肽。首先合成線性肽，并通過Asn/Asp（Asx）特異性連接酶將其環化。合成后的環狀細菌素在0.24-1.27 μmol/L濃度范圍內對大腸桿菌，金黃色葡萄球菌，糞腸球菌和單核細胞增生李斯特菌均有活性［32］。以HMPB-ChemMatrix樹脂為原料，采用Fmoc/tBu合成Pediocin PA-1。Pediocin PA-1的總產率為11%，對單核細胞增生李斯特菌的MIC值為6.8 μmol/L。Pediocin PA-1也顯示出對產氣莢膜梭菌的顯著抗菌活性［33］。化學合成是獲得純細菌素以避免微生物發酵后繁瑣純化細菌素的良好起點。但低產量仍是一個瓶頸，需要進一步優化工藝以提高產量。

3.3 異源表達法

隨著基因工程技術的廣泛應用，許多學者發現通過異源分泌表達產生細菌素可克服發酵法與合成法的部分缺點。通常用于產生細菌素的表達宿主為細菌和酵母細胞。

從中國大港油田中分離出熱反硝化地芽孢桿菌NG80-2。該分離物可表達廣譜地桿菌素I和II。在大腸桿菌BL21（DE3）細胞中擴增并異源表達地桿菌素I和II的編碼序列。與地桿菌素II相比，地桿菌素I對許多耐藥病原微生物具有活性。地桿菌素I與Nisin相似，它通過與脂質II分子結合以劑量依賴的方式抑制肽聚糖的合成［34］。因此開發異源表達系統以提高細菌素產量，且有助于擴大其在食品和制藥行業中的應用［35］。

4 細菌對細菌素產生耐藥性的機制

所有生物都有適應環境變化的內在趨勢。目標細菌持續暴露在細菌素當中會產生抵抗細菌素的成分，從而導致細菌素耐藥性。由于反復使用細菌素，致使某些細菌對細菌素的耐藥性日趨嚴重。目標細菌產生耐藥性的機制不同，革蘭氏陽性細菌的細胞壁由相對較厚的多層肽聚糖組成，溶葡萄球菌素可裂解葡萄球菌類細胞壁肽擴張層中的聚甘氨酸交聯鍵［36］。目標細菌也可通過中和細胞壁的凈負電荷來逃逸細菌素。細菌對細菌素產生耐藥性的機制各不相同，以下總結了細菌對細菌素產生耐藥性的常見機制。

4.1 細菌素對接分子膜受體的變化

細菌素系于脂質II、甘露糖磷酸轉移酶系統、十一異戊二烯焦磷酸磷酸酶、麥芽糖ABC轉運體和鋅離子依賴性金屬內肽酶上。甘露糖特異性磷酸轉移酶系統（Man PTS）基因在耐細菌素的單核細胞增生李斯特菌中表達較低，表明受體密度低影響細菌素的結合［36］。Garvicin ML需要麥芽糖ABC轉運體復合物作為受體，缺乏這種復合物會導致腸球菌科的耐藥性。

4.2 細胞壁磷壁酸的D-丙氨酸化

由于磷壁酸組成的變化，獲得耐藥性的細菌細胞壁負電荷降低。磷壁酸是一種富含磷酸根的陰離子聚合物，它由聚甘油磷酸酯組成，該磷酸甘油酯通過糖脂錨定蛋白與膜相連［37］，或聚核糖醇磷酸可形成磷壁酸核心，也可存在于其他多元醇中，如甘露醇、赤蘚糖醇和阿拉伯糖醇中。磷壁酸的核糖醇磷酸骨架可被D-丙氨酸取代以形成D-丙氨酸酯鍵。通常，磷壁酸給細胞壁帶來負電荷，但當它D-丙氨酸化后，給細胞壁帶來正電荷，從而導致陰離子聚合物的中和。金黃色葡萄球菌對達托霉素的耐藥性是由磷壁酸的D-丙氨酸化引起的。在革蘭氏陽性細菌中，由dlt操縱子編碼的4種蛋白質是合成磷壁酸D-丙氨酸酯所必需的。鼠李糖乳桿菌的研究表明了這4種蛋白質（DltA-D）的作用［38］。DltA充當D-丙氨酰-D-丙氨酸載體蛋白連接酶（Dcl），該酶通過ATP水解激活D-丙氨酸，并將其轉移至由dltC編碼的D-丙氨酸載體蛋白（Dcp）的磷酸泛素輔助因子上。疏水性DltB是一種膜蛋白，它是D-丙氨酸與磷壁酸結合和活化D-丙氨酸跨細胞質膜轉移所必需的。DltD負責將D-丙氨酸從膜載體DltB轉移到磷壁酸［38］。已發現金黃色葡萄球菌中dlt操縱子的失活賦予了病原菌對細菌素的敏感性。此外，糞便大腸桿菌和肺炎鏈球菌中dltA的缺失導致磷壁酸中缺乏D-丙氨酸，使該菌株對細菌素更加敏感［39］。與野生型相比，在糞便大腸桿菌的耐片球菌素的突變體中觀察到D-丙氨酸的變化：磷的比率增加，中和細胞壁表面電荷，從而增加了片球菌素擴散至增生間隙的通透性屏障［40］。

4.3 細胞膜磷脂的L-賴氨酰化

由于磷壁酸通過D-丙氨酸化成為一種毒力劑，一些細菌用L-賴氨酸修飾陰離子磷脂，產生堿性賴氨酰磷脂酰甘油，它賦予細胞質膜正電荷，可以保護細菌免受細菌素的侵害，包括達托霉素［41］。在高抗性單核細胞增生李斯特菌，金黃色葡萄球菌，糞腸球菌等菌株中，已觀察到膜磷脂的賴氨酸含量增加。由mprF基因編碼的MprF蛋白是磷脂賴氨酰化所必需的。事實上，MprF可用賴氨酸或丙氨酸修飾細菌磷脂酰甘油，以改變膜電荷［42］。

磷脂酰甘油的極性頭被Ala-tRNA（Ala）依賴性的丙氨酰-磷脂酰甘油合酶或Lys-tRNA（Lys）依賴性的賴氨酰-磷脂酰甘油合酶氨酰化，有利于易感細菌暴露在細菌素當中時得以生存［43］。這種含氨基酸的膜脂是應激狀態的標志，并適應不斷變化的環境條件［44］。

4.4 細胞膜脂肪酸組成的變化

耐細菌素病原體中飽和脂肪酸和支鏈脂肪酸的比例增加，可表現為更高的膜剛性，更少的流動性，防止細菌素滲透進入病原體細胞［45］。有趣的是，病原體采取相同的策略來逃避氨芐青霉素、氯霉素、紅霉素和四環素等抗生素。畢竟細菌素是抗生素的一個子集。芽孢桿菌和假單胞菌產生的AMPs被用作抗生素［46］，而LAB產生的AMPs被用作食品防腐劑。多黏菌素、達托霉素和表面活性物質等是具有抗生素用途的環脂肽［47］。

4.5 細菌素之間的交叉耐藥性

由于細菌素的聯合使用，尤其是具有不同作用機理的細菌素組合使用，可能會減少或阻止細菌素耐藥性的發展，因此對于確定“對兩種細菌素中的一種產生耐藥性之后是否會發生交叉耐藥性”至關重要［48］。Crandall等［49］報道單核細胞增生李斯特菌對Nisin的耐藥性賦予了對pediocin PA-1的交叉耐藥性。在另一項研究中，單核細胞增生李斯特菌顯示出對Nisin、pediocin PA-1和leuconocin S的耐藥性。Gravesen等［48］發現，Nisin和IIa類細菌素（pediocin PA-1和leucocin A）之間有一定程度的交叉耐藥性。他們還觀察到IIa類細菌素（pediocin PA-1、leucocin A和carnobacteriocin B2）之間完全交叉耐藥。

5 克服細菌素耐藥性的方法

細菌素可通過不同的機制產生耐藥性，即使是在同一菌種的不同菌株之間也是如此。此外，屬于不同類別的細菌素可能有相似的耐藥機制。但細菌素耐藥性的發展不會妨礙細菌素的預期用途，因為有一些策略可用于預防或克服這種耐藥性。

單憑細菌素可能不足以破壞食物中的病原微生物。過量的細菌素可能導致非特異性殺菌作用，并且可能對消費者造成危害。因此，考慮將細菌素與其他抗菌劑結合以增加其抑菌作用。在這方面，植物精油已顯示出希望［50］。百里香、小茴香、香菜、薄荷、鼠尾草、熏衣草、牛至和肉桂精油已被用作食品防腐劑。牛至精油（0.6%）和Nisin（500 IU/g）組合可抑制肉末腸炎沙門氏菌［51］。百里香精油（0.6%）與Nisin（500-1 000 IU/g）組合可抑制單核細胞增生李斯特菌的生長［52］。用Nisin（0.3 ppm）修飾的百里香素可抑制香腸中的傷寒沙門氏菌［53］。除精油外，輻照也可以提高細菌素的功效。封裝的Nisin與牛至和肉桂精油組合可增強單核細胞增生李斯特菌對γ射線的敏感性［54］。

除了將細菌素與其他抗菌化合物組合之外，將兩種具有不同作用機理的細菌素組合也可提高對細菌靶標的效力。細菌素的組合使最小抑菌濃度顯著降低，從而降低抑菌劑量。許多研究表明，將兩種細菌素一起使用具有很多優勢，如Nisin和Pediocin AcH或Leucocin F10的組合。當同時或按順序添加Nisin和Nisin 13時，可更有效地對抗單核細胞增生李斯特菌［55］。研究表明，細菌素AS-48和Nisin已被共同用于對抗金黃色葡萄球菌，并發現與單獨使用一種細菌素相比，該組合在抑菌方面更加有效。由于對特定細菌素的抗性可能會擴展到其他細菌素，尤其是同一亞類的細菌素［56］。因此，在組合使用不同的細菌素之前，應研究交叉耐藥性發展的初步測試，使耐藥性的出現最小化。

另一種方法是合理設計細菌素以提高抑菌活性。與抗生素不同，細菌素可以在某些氨基酸處突變，以使其更有效地對抗靶標。像Nisin A已通過單個Met21-Val取代被修飾為Nisin V，與Nisin A相比，其抗單核細胞增生李斯特菌的功效增強［57］。已經對Nisin進行了一些誘變研究，以提高其對革蘭氏陽性細菌和革蘭氏陰性細菌的功效。用乳鏈菌肽Durancin GL進行定點誘變的丙氨酸掃描突變分析表明，幾個氨基酸殘基對其抗菌活性具有重要意義，而突變后的殘基會提高抗菌活性［58］。Lacticin 3147還可以在選定的氨基酸殘基處突變，以增強其抗菌活性。研究表明，Bactofencin A已在幾個氨基酸殘基處突變，以了解哪些氨基酸殘基對其抗金黃色葡萄球菌活性是必不可少的，哪些氨基酸殘基突變以進一步增強其抑菌活性［59］。考慮到所有方法，生物工程技術將始終是增強細菌素抗菌活性最有希望的方法。

6 細菌素在食品領域的應用

如今，消費者要求提供安全、健康、美味、保質期長且加工少的食品。LAB是食品級微生物，已被廣泛用于食品保存中，其中許多具有GRAS安全性指標。因此，LAB產生的細菌素和其他代謝物通常也被認為是具有一定特性的安全化合物（如穩定性、抗菌活性、毒性低、無風味變化）［60］。到目前為止，只有Nisin和Pediocin PA-1被商業化為食品添加劑。但其他細菌素也為其在食品領域用作生物防腐劑提供了廣闊的前景，如腸球蛋白AS-48［61］。

細菌素在食品中的應用方式一般有兩種，一種是以純化或半純化細菌素制劑形式添加，如Nisin是50多個國家唯一獲許可用作生物防腐劑的細菌素。然而，由于多種因素，如吸附到食物成分，酶降解，不良的溶解性或食物基質中分布不均，細菌素在食物系統中的有效性通常很低。通過將產生活細菌素的細菌應用于食品中可克服使用純化細菌素的局限性［62］。將乳酸菌添加到乳制品（酸奶和奶酪）中將確保在整個成熟和儲存過程中連續產生細菌素，并可作為發酵中的輔助培養物使用。

另一種是以細菌產生的濃縮發酵液的形式添加。例如，ALTA 2431TM（Quest）是一種來自Pediocin PA的發酵產物［63］。產生細菌素的菌株也可直接接種到食品中作為發酵劑、輔料或保護性培養物。實際上，LAB及其細菌素已在傳統食品生產中用作發酵劑。但是在數千種細菌素中，只有少數用于食品保存，因為其他的是有毒的。中草藥中的細菌素和真菌毒素與肝毒性有關。同時細菌素是一組抗菌劑，能夠引起與抗生素相同的危害［64］。因此，應避免在食品等重要物品中濫用細菌素。在積極發現新的細菌素的同時，應積極探索其工程化、與其他殺菌劑相結合，同時也應探索其他食品保鮮方式，并降低細菌素的毒性，為其作為生物防腐劑奠定基礎。

近來，細菌素也被摻入包裝膜中以控制食源性致病菌，從而確保細菌素逐漸釋放到食品中并避免與食物成分相互作用而使細菌素失活［65］。此外，一些研究表明，與高壓、有機酸、酚類化合物和脈沖電場等物理化學方法結合使用時，細菌素對革蘭氏陰性菌的抗菌活性顯著增強。

7 展望

細菌素在食品加工、保存和食品安全中具有廣闊的應用前景。隨著分子生物技術的進步，基因工程技術的成熟，可通過基因工程和蛋白質工程以生產新型細菌素，從而提高細菌素的應用潛力。但是選擇新型細菌素作為生物防腐劑之前需深入了解細菌素產生的分子機制、免疫機制和作用方式，并進行綜合研究從而評估其安全性。雖然一些細菌素如Nisin在特定的食品體系中得到了商業化的應用，但由于細菌素的局限性以及各種食品基質的其他影響因素，限制了細菌素的廣泛應用。細菌素的這些局限性可通過設計細菌素，使其熱穩定和pH穩定、改善擴散率來克服。此外，生產和純化成本也阻礙了細菌素的廣泛應用。這些問題可通過細菌素在營養需求量最小的細菌宿主中異源表達來克服。這將在很大程度上直接降低生產成本。然而，像抗生素耐藥性一樣，細菌素耐藥性也可能是災難性的，因此在日常生活中探索使用細菌素時應格外小心。此外，還需要毒理學數據以確定GRAS的安全性指標和細菌素應用于食品中的法律批準。

細菌素可與其他保鮮方法結合使用，以減少微生物引起的食品腐敗。已經證明，使用化學防腐劑、物理處理（熱）或新型溫和的非熱物理方法（脈沖電場、高靜水壓、真空或改良的大氣包裝）可有效地提高許多細菌素的活性。使用合適的組合不僅在經濟上具有吸引力，而且可以提高食品的安全性、感官和營養質量。隨著將細菌素和產生細菌素的菌株摻入食品基質和包裝材料中的新技術出現，預計未來在食品保鮮行業中對細菌素的需求將會增加。因此，細菌素作為天然食品防腐劑顯然可以替代常規的苛刻的物理和化學防腐劑。