銻在斑馬魚不同組織中的積累及其對抗氧化系統的影響

徐琨 楊愛江，2，3 胡霞，2，3 鄒海洮 李彬 劉吉

（1. 貴州大學資源與環境工程學院，貴陽 550025；2. 貴州大學環境工程規劃設計研究院，貴陽 550025；3. 貴州喀斯特環境生態系統教育部野外科學觀測研究站，貴陽 550025）

銻（antimony，Sb）在自然界中分布廣泛，具有潛在毒性和致癌性，對心血管、呼吸系統和肝臟等具有危害［1-2］。銻主要有：-3、0、+3和+5四種價態形式，單質Sb毒性大于Sb化合物，無機銻毒性大于有機銻，Sb（III）化合物毒性是Sb（V）化合物的10多倍［3］。銻能通過風化、火山爆發、海洋噴濺、森林火災和生物源等自然排放過程釋放到環境中［4］，也可通過人類活動（采礦、冶煉和化石燃料燃燒等）向環境中釋放，造成環境的污染。中國是銻資源大國，銻儲、產量均位列全球第一［5］，隨之而來的是銻礦開采、冶煉及尾礦浸出液等大量含銻廢水排入附近水體，中國西南部的烏江、資江都受到了嚴重的銻污染［6］。有研究發現，湖南錫礦山周邊水體銻濃度最高可達29.42 mg/L［7］，新西蘭礦山附近Dúbrava水域銻濃度最高可達9.30 mg/L［8］，分別為世界衛生組織飲用水標準中銻限值的5 884.6、1 860倍，礦山水體銻污染形勢嚴峻。

當水生生物暴露在富含重金屬的水體中時，其組織和器官可通過不同方式富集重金屬，例如體表與水中重金屬的滲透交換作用，攝食、呼吸等生理途徑［9-10］。并會對生物體產生氧化脅迫作用，產生如超氧陰離子自由基（O2-·）、過氧化氫（H2O2）、羥基自由基（·OH）等對機體有害的活性氧自由基（reactive oxygen species，ROS）［11］。 為 應 對 這種氧化應激反應，生物體會產生如超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、過氧化氫酶（catalase，CAT）、谷胱甘肽（glutathione，GSH）等抗氧化劑，能結合并清除ROS，從而防止機體遭受氧化損傷［12］。通過研究機體抗氧化因子等生態毒理指標，可以初步了解重金屬對魚體抗氧化系統的影響［13-15］。本實驗受試生物斑馬魚是一種小型熱帶魚，因其具有與人類基因高度相似性、飼養容易、可全年連續繁殖、體積小，可大大降低試驗毒物的成本減少浪費等眾多優勢而成為生態毒理學研究的首選模式生物，被越來越廣泛地應用在生態毒理學及其他方面的研究中［16］。

本研究以斑馬魚為對象，研究不同濃度銻脅迫下Sb在斑馬魚肝、腦、鰓、肌肉中銻累積情況及其對各組織中超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化氫酶（CAT）、谷胱甘肽（GSH）及丙二醛（malondialdehyde，MDA）的影響，以期為礦山水體銻污染的生態毒理效應及生態風險評估提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試魚類與養殖條件 實驗成年斑馬魚采購于市場，體長2-4 cm。養殖于實驗室中，光暗周期為 t（光）∶t（暗）=16 h∶8 h。養殖水環境條件：水缸24 h曝氣、夏季及冬季水溫均維持28℃（斑馬魚生長最適溫度）、pH 6.8、溶解氧7.8-8.2 mg/L。自來水曝氣3 d后，放入斑馬魚進行養殖，配置自動過濾器、加熱棒。每三日清洗過濾器中糞便及殘余餌料，并補充蒸發水分（曝氣3 d），每日于9：00及17：00喂食兩次，馴養兩周，死亡率小于1%方可用于毒理實驗。

1.1.2 儀器 雙道原子熒光光度計（AFS-8520）、冷凍干燥機（PD-1A-50）、紫外分光光度計（S1020）、酶標儀（RT-6500）、冷凍離心機（H2-16KR）、全自動樣品冷凍研磨（JXFSTPRP-CL）、恒溫水浴鍋。

1.1.3 主要試劑 酒石酸銻鉀（分析純）、HNO3（優級純）、H2O2（優級純）、硫脲、抗壞血酸。試劑盒：總蛋白（TP）、丙二醛、還原型谷胱甘肽、超氧化物歧化酶、過氧化氫酶（所有試劑盒均購于南京建成生物工程研究所）。

1.2 方法

1.2.1 實驗設計 在課題組前期研究結果基礎上［17］，本實驗設 0、13.26、26.53、39.79 mg/L 4 個處理組，每個處理組設3個平行。魚缸暴露液體積2 L，每缸投放斑馬魚10條，實驗共進行14 d，實驗采用靜態換水法，每2 d更換50%銻溶液，每天于9：00和16：00進行喂食，實驗隨機取用成年斑馬魚，個體大小均勻未染病。解剖前24 h禁食，于暴露第14天時采集魚不同組織樣品。

1.2.2 樣品采集 于暴露第14天時撈出斑馬魚，用蒸餾水沖洗魚體表面并用濾紙吸干，冰浴解剖，迅速取斑馬魚肝臟、腦、鰓、肌肉等組織，并用預冷的0.9%生理鹽水進行沖洗，濾紙吸干并稱重后置于2 mL離心管中，處理后用于銻含量測定。將迅速解剖后的斑馬魚組織進行冰浴勻漿，制備組織勻漿液進行后續酶活測定。

1.2.3 樣品測定 將斑馬魚組織樣品進行冷凍干燥，并放入研磨機中研磨至粉狀，準確稱取0.01 g樣品于聚四氟乙烯的高壓密閉消解罐內膽中進行消解，用雙道原子熒光光度計進行測定。

按重量∶體積=1∶9加入冰生理鹽水，冰浴勻漿，將勻漿液于2 500 r/min離心10 min，取上清液即為10%的組織勻漿，稀釋10倍即得1%組織勻漿。TP、MDA、GSH、SOD依照試劑盒說明書進行處理、測定。其中，TP采用考馬斯亮藍法、MDA采用硫代巴比妥酸（TBA）法、GSH采用微板法、SOD采用羥胺法、CAT使用鉬酸銨法，使用紫外分光光度計及酶標儀進行測定。

1.2.4 數據分析 使用 SPSS 25統計軟件進行單因素ANOVA方差分析，P＜0.05表示差異顯著。使用Origin 2019進行繪圖。所有數據均表示為平均值±標準差。

2 結果

2.1 斑馬魚各組織中銻積累情況及含量變化

實驗測定了暴露于不同濃度Sb溶液中14 d后斑馬魚肝臟、腦、鰓、肌肉組織的積累情況及含量變化，如圖1所示。與對照組相比，Sb在斑馬魚各組織中均有明顯的積累，隨著脅迫濃度增大，Sb積累量增多，且積累順序為：肝臟＞鰓＞肌肉＞腦，銻最高積累量分別達到（mg/g）：87.70±3.97、14.10±1.40、27.72±1.80、14.38±0.25。

圖1 對照組和不同濃度銻處理組中斑馬魚肝、腦、鰓、肌肉中總銻含量Fig.1 Total antimony content in liver, brain, gill and muscle of zebrafish under different concentrations of antimony treatment

2.2 銻對斑馬魚各組織中SOD活性變化影響

圖2展示了不同濃度銻對斑馬魚各組織SOD活性變化影響。從圖中看出，隨著銻脅迫濃度升高，肝臟SOD活性也逐漸升高，在Sb濃度為39.79 mg/L時達到最大，為174.98 U/mgprot；鰓SOD活性隨著脅迫濃度的升高，呈現先升高再下降的趨勢，在Sb濃度為26.53 mg/L時達到最大，為158.43 U/mgprot；腦SOD活性隨著脅迫濃度的升高，呈現先下降再升高的趨勢，在Sb濃度為39.79 mg/L時達到最大，為118.41 U/mgprot；肌肉SOD活性隨著脅迫濃度的升高，呈現先下降再升高再下降的趨勢，在Sb濃度為0 mg/L時達到最大，為139.36 U/mgprot。

2.3 銻對斑馬魚各組織中CAT活性變化影響

圖3展示了不同濃度銻對斑馬魚各組織CAT活性變化影響。從圖中可以看出肝臟、腦、鰓、肌肉CAT活性隨著脅迫濃度的升高，均呈現先升高再下降的趨勢。除鰓（在Sb脅迫濃度為13.26 mg/L時達到最大，為22.45 U/mgprot）外，肝臟、腦、肌肉CAT活性均在Sb脅迫濃度為26.53 mg/L時達到最大，分別為 97.22、35.67、22.72 U/mgprot。

圖2 不同濃度銻處理組中斑馬魚肝、腦、鰓、肌肉SOD活性Fig.2 SOD activity in liver, brain, gill and muscle of zebrafish under different concentrations of antimony treatment

圖3 不同濃度銻處理組中斑馬魚肝、腦、鰓、肌肉CAT活性Fig.3 SOD activity in liver, brain, gill and muscle of zebrafish under different concentrations of antimony treatment

2.4 銻對斑馬魚各組織中GSH含量變化影響

圖4展示了不同濃度銻對斑馬魚各組織GSH含量變化影響。從圖中可以看出肝臟、腦、鰓、肌肉GSH含量隨著脅迫濃度的升高，均呈現先升高再下降的趨勢。除肝臟（在Sb脅迫濃度為26.53 mg/L時達到最大，為500.91 μmol/gprot）外，腦、鰓、肌肉GSH含量均在Sb脅迫濃度為13.26 mg/L時達到最大，分別為 1092.57、619.85、667.21 U/mgprot。

圖4 不同濃度銻處理組中斑馬魚肝、腦、鰓、肌肉GSH含量Fig.4 GSH content in liver, brain, gill and muscle of zebrafish under different concentrations of antimony treatment

2.5 銻對斑馬魚各組織中MDA含量變化的影響

圖5展示了不同濃度銻對斑馬魚各組織MDA含量變化影響。從圖中可以看出肝臟、腦、鰓、肌肉GSH活性隨著脅迫濃度的升高，呈現逐漸升高的趨勢。肝臟、腦、鰓及肌肉MDA含量均在Sb脅迫濃度為39.79 mg/L時達到最大，分別為30.27、44.68、34.62、28.50 μmol/gprot。

3 討論

3.1 斑馬魚各組織中銻積累情況及含量變化

魚類可不斷攝取蓄積水中重金屬，但魚體排出速率較小，重金屬在魚體中的濃度不斷增加，對魚類產生毒害作用［18］。本研究中，Sb可在斑馬魚各組織中積累，其中在肝臟、鰓中積累較多，在腦及肌肉中積累較少。這是由于肝臟是魚體內進行有毒物質轉化、儲存和解毒的重要場所，其中的金屬硫蛋白（metallothionein，MT）在受到重金屬刺激后可快速大量合成，因此肝臟中常積累大量重金屬［19］，任何對肝臟的損傷最終都會導致魚類生理上的紊亂，嚴重的會導致魚類的死亡。魚體通過鰓直接進行呼吸接觸水體，由于鰓膜能提供一個帶靜負電荷的表面［20］，因此鰓與其他器官相比，可直接與水相接觸吸附水中游離的重金屬離子，使更多的重金屬積累和吸附。相比之下，由于肌肉、腦等合成金屬硫蛋白能力較弱，對重金屬親和性較低，重金屬的積累量較其他組織少［21］。因而肝臟、鰓等新陳代謝活躍的魚類組織，與肌肉、腦等其他組織相比，可能會積累更高水平的金屬。El-Moselhy等［22］通過測定埃及紅海3個主要登陸區采集的14種底棲和遠洋魚類的肝臟、鰓和肌肉中5種重金屬的濃度發現，肌肉中5種重金屬的濃度最低，Cu、Zn和Fe在肝臟中濃度最高，Pb和Mn在鰓中的濃度最高；有研究發現，尖齒胡鯰魚在5 mg/L Cu溶液中暴露15 d后，肝臟中Cu含量最高，達到287.1 μg/g；其次為鰓積累量最多，為39.99 μg/g，而肌肉積累量最低，為 3.696 μg/g［23］。

圖5 不同濃度銻處理組中斑馬魚肝、腦、鰓、肌肉MDA含量Fig.5 MDA content in liver, brain, gill and muscle of zebrafish under different concentrations of antimony treatment

由于魚體內的金屬排除速度小于累積速度，因此重金屬將在魚體中積累并長時間存留［24］。重金屬對魚類死亡率的影響取決于暴露濃度及暴露時間［25］。本研究中，相同暴露時間下，隨著Sb暴露濃度的增加，各組織中Sb含量也逐漸增加。類似的關于重金屬濃度與魚體重金屬含量關系研究發現，幼年虱目魚分別暴露在鎘處理組（3.15、6.3和12.6 mg/L）中，3周后，肝鎘含量分別為129 mg/g±7 mg/g、222 mg/g±8 mg/g和 368 mg/g±22 mg/g，分別為對照組的90、160和260倍。Zhang等［26］研究發現，當金魚分別暴露于5 mg/L Cd、Pb溶液18 d時，其肝臟、鰓、腎臟組織中重金屬含量為0.5 mg/L Cd、Pb暴露時的1.14-3.97倍。

3.2 銻對斑馬魚各組織SOD活性變化影響

SOD是一類金屬酶，能與生物體內活性氧自由基發生反應，促使O2-·與H+歧化生成H2O2和O2，H2O2會被體內其他酶分解為無害的H2O，從而達到抗氧化的目的［27］。本研究中，肝臟、鰓中處理組SOD活性大于對照組，腦Sb（26.53、39.79 mg/L）處理組SOD活性大于對照組。這可能是由于長期暴露于Sb中，隨著Sb的積累，氧化脅迫程度加劇，使得SOD代償性大量表達，更積極地參與O2-·向H2O2的轉化［28］。這與 Aytekin 等［29］研究羅非魚暴露于0.1 mg/L和1.0 mg/g濃度的Cd+Cu+Cr+Pb+Zn溶液中7 d和14 d后，肝臟和鰓中SOD活性水平升高的結果相似。本研究中，暴露于Sb（26.53 mg/L）的鰓中SOD活性最高，大于Sb（39.79 mg/L）脅迫時SOD活性，表現為Hormesis毒物興奮效應［30］。肌肉處理組SOD活性均小于對照組，這可能是因為高濃度Sb脅迫下，產生過量活性氧自由基使得SOD產生與活性氧消除之間的平衡打破，SOD活性下降［31］。同樣的，將斑馬魚長期暴露于不同濃度鉈溶液中，鰓SOD活性在鉈濃度為0.5 μg/L時達到最大，后在1 μg/L時SOD活性開始下降，似乎存在一個閾值響應，而不是濃度響應［32］。將斑馬魚暴露于0.05%、0.25%、0.50%、1.00%鈾礦尾礦浸出液中14 d后發現肌肉SOD活性變化與本實驗結果相似［16］。腦在Sb（13.26 mg/L）脅迫下SOD值均明顯小于其余組，這可能是由于腦細胞在接觸到Sb后造成了部分損傷。隨著脅迫濃度增加，未損傷的細胞中SOD產生代償性表達，補償了受損細胞的部分。

3.3 銻對斑馬魚各組織CAT活性變化影響

CAT是一種含血紅素的酶，其可將H2O2代謝為H2O和O2來促進H2O2的去除，并阻止其與O2在鐵螯合物作用下反應生成有害的羥基自由基（·OH）［33-34］，CAT是所有酶中轉化率最高的酶之一：一個CAT分子每分鐘可以將600萬個H2O2分子轉化為H2O和O2［35］。在本研究中，斑馬魚各組織CAT活性隨著Sb的增加均呈現先升高后下降的趨勢，表現為Hormesis現象［30］。CAT活性在低濃度時升高可能是由于機體受到重金屬刺激后排毒機制啟動，誘導CAT活性的表達。在高濃度下活性抑制，這可能與金屬離子與酶分子上的-SH基團的直接結合，由于氧化應激而增加的過氧化氫和超氧自由基有關［36］。Xie等［37］研究黃鯰魚暴露于不同濃度的 Cd溶液（50、200 μg/L）中 56 d后，50 μg/L脅迫濃度時的CAT活性高于200 μg/L脅迫濃度時的CAT活性；麻艷群等［38］將禾花鯉暴露于不同濃度Cu（0、0.067、0.084、0.101、0.118、0.134 mg/L）的含鉛水溶液中11 d，發現低濃度Cu對血液和肝臟中的CAT活性具有一定的促進作用，高濃度時則相反。在本研究中，斑馬魚肝臟中CAT的活性是最高的，這與肝組織中Sb的生物積累量最高有關。

3.4 銻對斑馬魚各組織GSH含量變化影響

GSH可參與細胞抵御外源性藥物、氧自由基和金屬陽離子的毒性作用［39］。是一種富含巰基（-SH）的三肽，具有對金屬陽離子的高親和力的特征，可與各種金屬形成GS-金屬配合物［40］，并通過硫醇尿酸的形式排出體外，以此來改變金屬吸收和消除的速率，防止過量金屬離子對基本細胞結構造成損傷［41］。不同金屬對GSH含量水平的影響不同，GSH的含量通常取決于物種、組織、金屬及其暴露濃度［42］。通常，在接觸金屬后，細胞中的谷胱甘肽含量會增加或減少：有研究發現將Channa punctatus魚暴露于4種微量金屬鎘（Cd）、銅（Cu）、鐵（Fe）和鎳（Ni）溶液中，與對照組相比，暴露組GSH水平顯著增加［41］；而將其暴露于富含Fe和Ni的熱電廠廢水中時，與對照組相比，其鰓GSH水平有所下降［43］。本研究中，各組織GSH水平較對照組高，并隨濃度升高，變化趨勢為低濃度促進，高濃度抑制，這可能是由于在低濃度下，機體氧化應激系統及抗氧化防御系統被激活，快速合成大量GSH與重金屬結合，并清除重金屬脅迫產生的ROS。而高濃度時GSH 含量的下降可能是由于GSH低濃度時其消耗速度大于其產生的速度，動態平衡打破，從而導致含量下降［44］。肖丹［45］、Canesi等［46］也在生物體內探究時觀察到一致的現象。

3.5 銻對斑馬魚各組織MDA含量變化影響

過量ROS能攻擊生物膜上的磷脂、膜受體和酶相關的多不飽和脂肪酸等大分子物質［47］，損害膜的功能，產生脂質過氧化，脂質過氧化作用的后續產物（如氫過氧化物或醛衍生物）還可以通過抑制蛋白質合成和酶活性來改變細胞功能［48］。MDA是脂質過氧化的二級產物，通常作為脂質過氧化的生物標志物［49］。本研究中，不同濃度Sb脅迫下，斑馬魚各組織中MDA含量隨著Sb濃度的增加而增加，表明水相Sb暴露下，Sb誘導了魚體產生過量ROS，發生脂質過氧化，。Geng等［16］將斑馬魚暴露于不同濃度（0.05%、0.25%、0.50%、1.00%）鈾礦尾礦浸出液中14 d，曾樂意等［50］通過飼喂中華倒刺鲃不同濃度（2 500、5 000 μg/g）Pb飼料56 d后，發現魚體各組織中MDA含量均與重金屬濃度呈正相關關系，本實驗結果相似。

4 結論

不同濃度銻脅迫下，斑馬魚各組織可產生明顯的銻積累，積累順序為：肝臟＞鰓＞肌肉＞腦，且隨著暴露濃度不斷增大，銻積累量也逐漸增多，各組織最高銻積累量分別達到：87.70 mg/g±3.97 mg/g、27.72 mg/g±1.80 mg/g、14.38 mg/g±0.25 mg/g、14.10 mg/g±1.40 mg/g。對SOD、CAT、GSH及MDA等生化指標的研究發現，銻暴露可使機體產生脂質過氧化，同時激活抗氧化防御系統緩解毒害作用，并隨著脅迫濃度的增加產生一定的變化趨勢。