黃芩多糖的提取及其抗氧化和抗腫瘤活性研究

李平 胡建燃 史寶忠 趙晶磊

（長治學院生物科學與技術系，長治 046011）

黃芩是我國傳統的道地藥材，在臨床上已有2 000多年的應用歷史，最早記載于《神農本草經》，又名山茶根、黃金茶，是唇形科草本植物黃芩（Scutellaria baicalensis Georgi）的干燥根。黃芩產于我國山西、內蒙古、河北、陜西、山東和黑龍江等地，以根入藥，能夠瀉火解毒，清熱燥濕，安胎止血［1］，臨床上主治胸悶嘔吐，上呼吸道感染、濕熱黃膽、肺熱咳嗽、目赤等癥［2］。《全國中成藥產品目錄》的統計結果顯示，70%的中成藥都含有黃芩成分。黃芩含有黃酮類化合物、萜類化合物、多糖、揮發油等化學成分［1-2］，目前國內外對黃芩黃酮的相關研究報道很多，而對黃芩多糖（S. baicalensis polysaccharides，SBP）生物活性得研究報道比較少，其中對于SBP的抗腫瘤活性尚未見詳細報道。

植物多糖是重要的生物大分子，參與多種生命活動，具有多種藥理活性，如抗腫瘤、抗病毒、抗氧化、降血糖及抗衰老等，是近年來國內外的研究熱點。對于SBP的研究起步較晚，主要是關于SBP提取的研究，而對其活性和功能研究較少。張文等［3］用 85%的乙醇加熱回流提取SBP，苯酚-硫酸法測定多糖含量，測得SBP含量為 5.388%，平均回收率為98.8%。梁英等［4］用水作提取試劑，應用二次回歸正交旋轉組合設計對SBP提取進行工藝優化，得出在最優條件下，SBP提取率是 4.92%。張道廣等［5］考察了SBP對豬生殖和呼吸系統綜合征病毒在傳代細胞系 MARC-145細胞中增殖的影響，研究結果顯示SBP具有細胞水平抑制病毒增殖的作用。何雯娟等［6］研究發現，SBP對肉仔雞法氏囊指數有顯著影響，能夠顯著提高肉仔雞免疫球蛋白水平。李國峰等［7］研究了SBP的體內抗氧化活性，發現SBP能使衰老模型小鼠腦、肝中的丙二醛（malondialdehyde，MDA）不同程度下降；超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）和還原型谷胱甘肽（reduced glutathione，GSH）不同程度升高。但是，目前尚未有文獻報道SBP對腫瘤的作用。

本研究利用水提醇沉法、微波提取法及超聲波提取法對SBP進行了提取，比較3種方法的提取率。考察了SBP對超氧陰離子自由基和羥基自由基的清除能力，以及總抗氧化能力，系統地研究SBP的體外抗氧化能力。此外，還檢測了SBP對胃癌細胞MGC80-3的抑制能力，并進一步探討了潛在的分子機制，以期為SBP的綜合開發利用提供理論依據，也為抗氧化保健品和抗腫瘤新藥的開發提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 材料與試劑 本實驗所用中藥黃芩購自長治市昂生大藥房。胃癌細胞系 MGC80-3 購自武漢博士德生物工程有限公司。RPMI-1640細胞培養基和胎牛血清均購自美國Thermo Fisher Scientific公司。3-（4，5-二甲基 -2-噻唑基）-2，5-二苯基四氮唑溴化 物（3-（4，5-Dimethyl-2-thiazolyl）-2，5-diphenyl-2H-tetrazolium bromide，MTT）、Trolox試 劑、ECL顯色試劑盒和BCA蛋白濃度測定試劑盒購自北京索來寶生物科技有限公司。二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）和2，6-二叔丁基對甲酚（2，6-Ditert-butyl-4-methylphenol，BHT）購自美國 Sigma公司。兔抗IKK β抗體和兔抗caspase3抗體購自Abcam公司，鼠抗Akt抗體購自Santa Cruz公司，兔抗LC3 A/B抗體、兔抗IκB α抗體和兔抗p-IκB α抗體購自Cell signaling Technology公司，兔抗GAPDH抗體購自北京博奧森生物技術有限公司。羥自由基測試盒、超氧陰離子自由基測試盒和總抗氧化能力測試盒均購自南京建成生物工程研究所。其余所用試劑，如無水乙醇、無水甲醇、乙醚、3，5-二硝基水楊酸、苯酚和硫酸等均為國產分析純。實驗用水為雙蒸水。

1.1.2 儀器與設備 RE-5ZAA旋轉蒸發器（上海壓榮生化儀器廠）；FDV超細粉碎機（北京興時利和科技發展有限公司）；BSA 124S-CW 電子天平（賽多利斯科學儀器（北京）有限公司）；P70F23P-G5（SO）微波爐（廣東格蘭仕微波生活電器制造有限公司）；5805 臺式高速離心機（北京博瑞祥騰科技有限公司）；DFY-300 高速萬能粉碎機（上海新諾儀器設備有限公司）；CO2培養箱（美國熱電公司）；MAPADA P4紫外可見分光光度計（上海美譜達儀器有限公司）；多功能酶標儀SpectraMax M2（美谷分子儀器（上海）有限公司）；倒置顯微鏡CKX41-C31BF（日本Olympus公司）；KQ-250 醫用超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；細胞計數儀Cellometer Auto1000（美國Nexcelom公司）；蛋白電泳系統和ChemiDoc MP成像系統（美國Bio-Rad公司）。

1.2 方法

1.2.1 黃芩粗多糖的提取

1.2.1.1 水提醇沉法 參照文獻［8］的方法，并進行適當改良。稱取粉碎的黃芩粉末 5 g，加入石油醚，加熱回流提取2 h，除去脂溶性成分。濾渣揮干溶劑，加入100 mL的蒸餾水，煮沸 2.5 h 后，過濾并收集濾液。將濾渣重復煮沸 2 次，合并濾液，調節pH至6.5，然后4 000 r/min離心10 min，取上清液。在上清液中加3倍體積的無水乙醇，在 4℃冰箱靜置過夜，離心收集沉淀，依次用80%乙醇和丙酮進行洗滌、干燥，即得黃芩粗多糖。

1.2.1.2 微波提取法 參照文獻［8］的方法，并進行適當改良。稱取粉碎的黃芩粉末 5 g，加入石油醚，加熱回流提取2 h，除去脂溶性成分。濾渣揮干溶劑，加入100 mL的蒸餾水，將其置于微波爐700 W功率下，加熱 20 min，冷卻后，后續步驟同1.2.1.1，即得黃芩粗多糖。

1.2.1.3 超聲波提取法 參照文獻［8］的方法，并進行適當改良。稱取粉碎的黃芩粉末 5 g，加入石油醚，加熱回流提取2 h，除去脂溶性成分。濾渣揮干溶劑，加入100 mL的蒸餾水，超聲提取2 h，后續步驟同1.2.1.1，即得黃芩粗多糖。

1.2.2 SBP的精制

1.2.2.1 除蛋白 參照文獻［8］，利用Sevag法進行蛋白脫除。取黃芩粗多糖，加水溶解后，加入多糖水溶液25%體積的 Sevag試劑（氯仿∶水飽和正丁醇＝4∶1的混合液），充分混合，劇烈震蕩 30 min，然后4 500 r/min 離心 10 min，收集水相，重復7-9次。

1.2.2.2 除去小分子和離子 參照文獻［8］，將上述除蛋白后的溶液放入透析袋（8 000-14 000）中，用蒸餾水流動透析24 h，加入3 倍體積的無水乙醇，4℃靜置過夜，4 000 r/min離心10 min，收集沉淀，洗滌，干燥后即為精制SBP，于4℃冰箱中保存備用。

1.2.3 SBP含量的測定 用適量蒸餾水將精制的SBP溶解后，配制成0.2 mg/mL的多糖儲備液。利用苯酚-硫酸法［9-10］測定其多糖的含量，并進而計算出多糖提取率。

1.2.4 SBP的體外抗氧化活性檢測 參照文獻［11］的方法，檢測多糖樣品的羥自由基清除能力、超氧陰離子自由基清除能力及總抗氧化能力，按照試劑盒說明書進行操作，每個樣品設置3個重復。

1.2.4.1 多糖的羥自由基清除能力檢測 將精制的SBP用蒸餾水稀釋成0.125、0.25、0.5、1.0、2.0和5.0 mg/mL系列濃度，并配制同樣濃度梯度的水溶性維生素E（Trolox）作為陽性對照，按試劑盒說明書的步驟進行檢測。羥自由基清除率計算公式：

清除率%=（OD對照組-OD測定組）/OD對照組×100%

根據不同濃度的多糖溶液對羥自由基的清除率，通過擬合計算清除率為50%時的 樣 品濃度，即為EC50值，樣品的EC50值越小，其清除羥自由基能力就越強。

1.2.4.2 多糖的超氧陰離子清除能力檢測 將精制的SBP用蒸餾水稀釋成0.125、0.25、0.5、1.0、2.0和5.0 mg/mL系列濃度，并配制同樣濃度梯度的水溶性維生素 E（Trolox）作為陽性對照，按試劑盒說明書的步驟進行測定，在 550 nm 波長處測定吸光值，并計算超氧陰離子自由基清除率，公式同 1.2.4.1。

根據不同濃度的多糖溶液對超氧陰離子自由基的清除率，通過擬合計算清除率為50%時的樣品濃度，即為該樣品對超氧陰離子自由基清除能力的EC50值。

1.2.4.3 多糖的總抗氧化能力（T-AOC）測定 配制 5.0 mg/mL 的SBP溶液，取0.1 mL多糖溶液，根據試劑盒說明書進行總抗氧化能力（total antioxidant capacity，T-AOC）測定。以Trolox為陽性對照，測定 520 nm 處的吸光值。定義：在37℃時，每分鐘每毫克SBP，使反應體系的吸光度值每增加0.01時，為一個總抗氧化能力單位。計算公式如下：

T-AOC（U/mg）=（OD測定組-OD對照組）×Vs/（Vt×△OD×T×Mt）

式中：Vs 為反應體積3.7 mL；Vt 為參與反應的多糖樣品或陽性對照樣品體積0.1 mL；ΔOD 為吸光值單位增加值 0.01；T 為反應時間 30 min；Mt為樣品濃度（5 mg/mL）。

1.2.5 SBP抗腫瘤活性研究

1.2.5.1 細胞的培養 參照文獻［12］的方法，將胃癌細胞MGC80-3采用含10%胎牛血清的RPMI-1640培養基進行培養，置于含5% CO2的培養箱中，培養溫度為37℃，待其匯合率達到約80%時，用胰酶-EDTA消化液將細胞消化下來，進行傳代培養。

1.2.5.2 MTT實驗 參照文獻［12］的方法，細胞計數后，按照約5 000個細胞/孔的密度接種到96孔板中，每孔加入200 μL，進行培養，待細胞完全貼壁后，分別加入不同濃度的SBP溶液處理細胞，多糖溶液終濃度為2.5、1.25和0.625 mg/mL。同時設置對照組，每組設3個復孔，置于 5% CO2、37℃ 培養箱中培養24 h和 48 h。培養結束后，棄去培養基，并加入新鮮培養基，添加1 /10體積的5 mg /mL MTT溶液，繼續孵育4 h后，然后倒掉培養基，加入150 μL DMSO，振蕩15 min，待藍色物質完全溶解后，測定OD570值，并計算抑制率，抑制率計算公式如下：

細胞生長抑制率%＝（OD對照組-OD測定組）/OD對照組×100%

1.2.5.3 Western blot實驗 將MGC80-3細胞接種于Φ35 mm培養皿中，用不同濃度的SBP處理細胞48 h后，收集細胞，用冰預冷的PBS溶液洗滌，加入適量含蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑的RIPA細胞裂解液，置于冰上孵育30 min，在4℃下12 000 r/min離心15 min，收集上清液，利用BCA法檢測蛋白質濃度。然后，經SDS-PAGE電泳、轉膜、一抗（見1.1.1部分）4℃過夜孵育、二抗（HRP標記的鼠二抗或兔二抗）常溫孵育1 h及PBS-T溶液漂洗后，利用ECL試劑盒顯色，在成像系統下進行拍照。

1.2.6 數據分析 利用Graphpad 5.0軟件對實驗數據進行t檢驗。實驗數據均以平均值±標準差（± s）表示。

2 結果

2.1 SBP提取方法的確定

稱取等量的黃芩粉末，通過水提醇沉法、微波提取法和超聲波提取法分別提取SBP，然后通過苯酚-硫酸法測定多糖含量，計算出各自的提取率。微波提取法的提取率最高，達到（7.26±0.33）%，其次是超聲波提取法，提取率為（5.27±0.37）%，而水提醇沉法提取率最低，為（3.20±0.21）%。因此，在多種提取方法，通過微波提取法提取效率最高，可以得到最多的SBP。

2.2 SBP的體外抗氧化活性

2.2.1 SBP的羥自由基清除能力 分別將SBP和陽性對照 Trolox 稀釋成一系列濃度梯度后，檢測其羥自由基清除活性。結果如圖1所示，SBP對羥自由基的清除能力隨著樣品濃度的增加而增大，呈現出明顯的量效關系。當多糖濃度 5.0 mg/mL 時，對羥自由基的清除率達到 91.30%。根據各個濃度下清除率數據，計算SBP對羥自由基清除能力的EC50值是1.298 mg/mL，Trolox 的 EC50值為 1.90 mg/mL，高于SBP的EC50值。EC50值越高，則樣品的羥自由基清除能力越弱。表明SBP具有較好的羥自由基清除能力，而且在相同濃度下，其清除率顯著高于陽性對照Trolox，開發前景很好。

圖1 SBP的羥自由基清除能力檢測Fig.1 Hydroxyl radical scavenging capacity of SBP

2.2.2 SBP的超氧陰自由基清除能力 分別將SBP和陽性對照 Trolox 稀釋成一系列濃度梯度后，檢測其超氧陰離子自由基清除活性。結果如圖2所示，SBP和 Trolox的超氧陰離子清除效能力仍然與其濃度呈明顯的劑量依賴效應，但是與 Trolox 相比，SBP的清除作用相對較低。當樣品濃度為 5.0 mg/mL 時，SBP的超氧陰離子清除率達到43.06%。研究結果表明SBP具有一定的超氧陰離子清除能力，在相同濃度下，其清除能力弱于Trolox。

2.2.3 SBP的總抗氧化（T-AOC）能力 將精制的SBP配制成5 mg/mL的溶液，檢測其總抗氧化能力，結果如圖3所示。SBP的總抗氧化能力為（3.27±0.14）U/mg，陽性對照 Trolox的總抗氧化能力為（3.64±0.21）U/mg。結果表明，二者無顯著差異（P = 0.064），即表明SBP與 Trolox 具有相當的總抗氧化能力，結合其羥自由基和超氧陰離子自由基的清除效果，提示SBP具有開發為天然抗氧化劑的潛力。

圖2 SBP的超氧陰離子清除能力檢測Fig.2 Superoxide anion radical scavenging capacity of SBP

圖3 SBP總抗氧化能力檢測Fig.3 T-AOC detection of SBP

2.3 SBP的抗腫瘤活性

2.3.1 SBP對胃癌細胞MGC80-3增殖的影響 利用不同濃度的SBP處理胃癌細胞MGC80-3，通過MTT實驗檢測抑制率。結果如圖4所示，當SBP終濃度從 0.16 mg/mL 增大至2.50 mg/mL 時，對 MGC80-3細胞的抑制率逐漸升高，其中處理24 h時，抑制率從7.07%升高至60.93%，處理48 h時，抑制率從48.54%升高至89.63%，在相同濃度下，處理48 h后的抑制率明顯高于處理24 h的抑制率（P＜0.01）。經計算，IC50分別為1.214 mg/mL和0.174 mg/mL。表明SBP對MGC80-3細胞的抑制作用具有劑量和時間依賴性。

2.3.2 SBP對胃癌細胞MGC80-3形態的影響 SBP對MGC80-3細胞形態的影響結果如圖5所示，對照組細胞形態飽滿，生長緊密。用SBP分別處理24 h和48 h后，細胞數量明顯減少，細胞收縮，變為球形，隨著多糖濃度升高，越來越多的細胞膜結構出現破壞，細胞間隙間中出現細胞碎片。而且處理時間越長，細胞表面褶皺程度越高。

圖4 SBP對MGC80-3細胞增殖的抑制作用Fig4 Inhibitory effects of SBP on the cell proliferation of MGC80-3 cells

圖5 SBP對MGC80-3細胞形態的影響Fig.5 Effects of SBP on the morphology of MGC80-3 cells

2.3.3 SBP抑制MGC80-3細胞增殖的分子機制探討 為進一步揭示SBP抑制MGC80-3細胞增殖的分子機制，以GAPDH為內參，通過Western blot檢測相關蛋白的表達和活性（圖6）。通過對蛋白條帶的灰度進行分析，如圖7和圖8所示，IKK β和procaspase3均隨SBP濃度升高而表達增強。此外，LC3 B和LC3 A以及cleave-caspase 3和pro-caspase 3比值也與SBP濃度呈正相關，表明SBP既可能觸發MGC80-3細胞自噬，同時也可能誘導其凋亡。此外，值得注意的是，在低濃度SBP（0.156 mg/mL）處理細胞時，Akt的表達以及p-IκB α水平顯著提高，但是隨著SBP濃度升高，二者水平則出現明顯下調，表明低濃度SBP能誘導Akt和p-IκB α水平升高，但高濃度對二者可能產生抑制作用。

圖6 Western blot實驗Fig.6 Western blot assay

圖7 相關蛋白質表達水平分析Fig.7 Expression level analysis of associated proteins

圖8 相關蛋白活性形式含量分析Fig.8 Content analysis of active forms of associated proteins

3 討論

黃芩是多年生草本植物，以根部入藥，耐寒冷，喜溫和氣候。黃芩是山西省的道地藥材，品質優良，野生黃芩資源在全省各地都有分布，人工種植面積也居于全國前列［13］。多糖是黃芩的重要組成部分，但是目前針對黃芩多糖的研究相對較少，還處于初步階段。植物多糖的提取方法常有水提醇沉法、微波提取法、超聲波提取法等，本研究比較了這些提取方法的RGP提取率，其中微波提取法最高，達到7.26%，為進一步的提取工藝優化奠定基礎。此外，本研究進一步除去粗多糖中的蛋白成分和小分子，得到精制的SBP，然后分析其抗腫瘤活性和抗氧化能力。

目前對黃芩藥理活性成分研究較多的是黃酮類化合物，包括黃芩素、黃芩苷、漢黃芩苷等。Wang等［14］研究發現黃芩苷-鋅復合物有較低的細胞毒性和較高的抗HIV-1活性，并能有效抑制 HIV- 1進入宿主細胞。蘇寧等［15］研究發現黃芩苷能提高糖尿病腎病大鼠腎組織中的SOD和GSH-PX 活性，延緩糖尿病腎病的發展進程。此外，研究表明黃芩苷對人黑色素瘤 A375 細胞［16］、胃癌細胞 SGC-7972［17］、S180實體瘤細胞［18］等多種腫瘤有抑制作用。

體內產生的過量氧自由基，可使 DNA 損傷，導致細胞膜的降解，從而引起細胞的破壞和機體組織的損傷，成為衰老及多種疾病，如癌癥、心血管疾病、糖尿病及風濕性關節炎等的共同誘因。適當補充抗氧化劑，能促使體內自由基水平達到的平衡。近年來，安全低毒的天然抗氧化劑的開發備受關注。大量研究表明，多種中藥的多糖成分具有良好的抗氧化效果。張全才等［19］在體外實驗中證實山楂多糖對超氧自由基、羥自由基和DPPH自由基均具有一定的清除能力；蔡惠鈿等［20］發現無花果多糖在2 500 μg/mL時對超氧陰離子和羥基自由基的清除率分別達到75%和38%，而在1 000 μg/mL時還原能力最強；許春平等［21］則發現枸杞多糖在經過羧甲基化修飾后，其清除羥自由基和DPPH自由基的能力顯著增強；史娟等［9］證實白花蛇舌草多糖對DPPH自由基具有良好的清除作用，而pH值、溫度、光照和金屬離子對其上述作用都有一定程度的影響。目前，有少量針對SBP抗氧化能力的報道，如金迪等［22］發現其自制的SBP還原力較低，但是對DPPH和超氧陰離子的清除能力強于維生素C；另外，劉夢杰等［23］證實SBP能顯著提高小鼠血清、肝臟、脾臟和腎臟中GSH-Px和SOD活性，顯著降低其中MDA水平。本研究結果顯示，與抗氧化劑Trolox相比較，SBP對羥自由基的清除能力較強，對超氧陰離子自由基的清除能力相對弱于Trolox，而其總抗氧化能力（T-AOC）與Trolox相當，表明本研究所獲得的SBP具有較為理想的抗氧化能力，與上述文獻報道一致。

在抗腫瘤方面，誘導細胞凋亡是中藥抗腫瘤活性成分的主要作用途徑。例如，Qiu等［24］發現從中藥天麻中獲得并修飾的多糖化合物WSS25能夠通過靶向BMP2蛋白及其受體，阻斷BMP/SMAD/ID1信號通路，在體內誘導肝癌細胞凋亡。Li等［25］認為黃精多糖能夠調控Bak、Cytc、Puma和caspases-3、-7、-9等多個凋亡相關基因的表達，誘導HeLa細胞凋亡。Guo等［26］的研究發現黃芪多糖可能通過microRNA-27a/FBXW7信號途徑誘導卵巢癌細胞凋亡。Wang等［27］的研究發現人參漿果多糖能夠促進結腸癌細胞凋亡，并增強其對5-氟尿嘧啶的敏感性。本研究發現SBP能夠有效抑制胃癌細胞MGC80-3的增殖，進一步的分子機制研究發現SBP能夠提高caspase 3活性形式水平，表明可能促進了細胞凋亡。此外，值得注意的是，SBP還使細胞自噬標志因子LC3 B的水平顯著升高，表明可能還觸發了細胞自噬途徑，目前尚未有文獻揭示SBP和腫瘤細胞自噬過程之間的關系。而Akt和IκB α相關信號通路則可能是SBP誘導細胞凋亡和自噬的重要分子機制之一。然而，SBP的成分和結構以及進一步的抗腫瘤信號分子網絡還需要更為深入的研究予以揭示。

4 結論

利用3種方法提取SBP，通過比較提取率，確定微波提取法最佳。通過體外抗氧化實驗，證實SBP具有較強的羥自由基清除能力、一定的超氧陰離子清除能力和較強的總抗氧化能力。通過MTT實驗和細胞形態觀察，證實SBP能夠顯著抑制胃癌細胞MGC80-3的增殖，改變細胞形態。通過western blot實驗，證實SBP能夠顯著影響Akt、caspase3、LC3 和 IκB α 的表達及活性。