miRNA-132靶向SCN2A調控對癲癇大鼠海馬區細胞凋亡的影響

李順鈞 浦蘇穎 王慧 李云霞

(1.上海市徐匯區大華醫院神經內科，上海 200237；2.上海市同濟醫院神經內科，上海 200065)

癲癇發作與患者腦組織多種細胞蛋白代謝有關，會導致多種基因模式發生改變[1]。miRNA參與癲癇發展主要是通過參與神經系統中炎癥發應、神經細胞凋亡、神經元壞死、樹突生長、膠質細胞增生等過程，同時在癲癇網絡形成，神經遞質以及機體損傷過程中發揮重要作用[2]。J.Yuan等[3]研究指出，神經系統因為各種病理改變，造成海馬內回返興奮性環路形成，促進癲癇發生。SCN2A在不同類型的癲癇患者中均有SCN2A基因突變，通過SCN2A編碼的神經元電壓門在調控鈉離子通道中發揮重要作用[4]。有研究[5]顯示，靶向SCN2A基因治療癲癇效果明顯。本文旨在研究miRNA-132靶向SCN2A調控對癲癇大鼠海馬區細胞凋亡的影響。

1 材料與方法

1.1動物和主要試劑 清潔級雄性SD大鼠60只，大鼠8～10周齡，平均(9.8±1.2)周齡，體重200～220 g,平均(210.4±5.2)g，由海南醫學院實驗動物中心提供。本文研究所做實驗均獲得我院倫理委員會批準。主要試劑：大鼠抗小鼠Bcl-2、Bax、Akt抗體(英國Abcam公司)。

1.2方法 30只大鼠隨機分為模型組、過表達組、沉默組，各10只。使用127 mg/kg氯化鋰給予腹腔麻醉，24 h后給予1 mg/kg丁溴東莨菪堿進行腹腔麻醉，30 min給予30 mg/kg 1%的匹羅卡品腹腔麻醉，按照Racine分級標準，如果無發作或者發作未達到Ⅳ級，每間隔30 min給予10 mg/kg匹羅卡品腹腔麻醉，出現癲癇持續狀態即建模成功。三組大鼠海馬區細胞在培養瓶中融合率在75%左右時進行轉染，測量細胞密度后以每個六孔板中約4×105個細胞進行種植，加入到3 mL新鮮培養基中之后進行孵育培養(5%CO2、溫度溫度為37℃)的培養箱中，細胞孵育到融合率在40%～80%之間時取1.5 μL的質粒DNA溶于100 μL的雙抗培養基中(不含血清)，充分混合后進行離心，在EP管中加入12 μL的PolyFect Reagent，上下重復顛倒5次進行混勻處理，于室溫環境下進行靜置5～10 min，吸去置于六孔板中的培養基，加入3 mL的新鮮完全培養基，在含有轉染復合體的EP管中加入含有血清和雙抗的600 μL完全培養基，上下重復顛倒2次后加入六孔板中進行培養，24 h后進行常規的換液處理，再次繼續24 h的培養，倒置，使用熒光顯微鏡下對熒光亮度進行觀察，對細胞進行收集，提取細胞RNA，鑒定轉染效率，將轉染效率最高的質粒組、空載組稀釋液接種于10 mm2培養皿中(PCR驗證篩選)，將40 μL嘌呤霉素加入每孔后常規培養，培養3 d后棄培養液，選取經過PCR驗證篩選的細胞進行消化處理后稀釋，接種在24孔板中，最終建立穩定轉染的過表達組、沉默組。建模成功后處死大鼠，提取大鼠海馬區組織制作標本，使用40 mL/L的多聚甲醛進行固定，常溫下使用15%的EDTA脫鈣，脫水后進行石蠟包埋，制作3 μm的組織切片，HE染色。TRIzol提取細胞RNA，經過電泳檢測RNA并定量，經過逆轉錄合成cDNA。進行實時熒光定量PCR實驗，探針或SYBR反應25 μL，反應條件滿足：94℃ 5 min,94℃ 45 s,60℃ 1 min,40個循環,設置標準組和空白對照。將PCR反應實驗前3～15個循環熒光信號作為熒光本底信號，調節基線，采用2-△△CT分析SCN2A基因表達。使用10%的胎小牛血清培養液配成單個細胞懸液，以每孔1 000～10 000個細胞接種到96孔板，每孔體積為200 μL。培養24，48，72 h后，每孔加MTT溶液(5 mg/mL PBS配置)20 μL。繼續孵育4 h，結束培養，棄上清液。每孔中加入150 μL DMSO，振蕩10 min。選擇490 nm波長，使用酶聯免疫監測儀檢測各孔光吸收值。將各組細胞轉染質粒24 h后，將細胞用不含EDTA的0.25%胰酶消化5 min至細胞瓶表面呈霧狀，PBS吹打下來，4℃ 2 000 rpm 3 min，PBS洗滌、離心、重懸2次，流式細胞儀分析細胞凋亡率。常規蛋白提取，采取BCA法進行定量分析。50 μg的蛋白樣品上樣后SDS-PAGE電泳，通過蛋白電轉到PVDF膜，使用5%的脫脂奶粉TBST中進行避光封閉1 h，洗滌之后加入一抗稀釋溶液(Bcl-2、Bax、Akt按照1∶1 000比例進行稀釋)，在4℃的環境中過夜保存，洗滌后加入二抗稀釋溶液(Bcl-2、Bax、Akt按照1∶5 000比例進行稀釋)，在溫床中孵育1 h后再次洗滌，加入發光液ECL，曝光2～3次，取重疊值。使用軟件分析蛋白條帶灰度值，內參蛋白是GAPDH。

2 結 果

2.1病理學觀察 模型組大鼠海馬區細胞腫脹，部分破裂，排列紊亂(黑色箭頭表示)；過表達組大鼠海馬區細胞損傷明顯，細胞萎縮、腫脹、破裂嚴重，染色質和細胞核濃縮。沉默組大鼠海馬區細胞排列較整齊，細胞腫脹明顯降低。見圖1。

2.2SCN2A在癲癇大鼠中的表達 三組SCN2A mRNA表達分別為：模型組(1.26±0.21)、過表達組(0.56±0.15)、沉默組(1.62±0.32)。與模型組相比，過表達組SCN2A mRNA表達降低；沉默組SCN2A mRNA表達升高(P<0.05)。與過表達組相比，沉默組SCN2A mRNA表達升高(P<0.05)。三組比較差異均有統計學意義(F=14.227，P均<0.001)。

2.3海馬區細胞增殖率的比較 與模型組相比，過表達組海馬區細胞增殖率降低，沉默組海馬區細胞增殖率升高(P<0.05)。與過表達組相比，沉默組海馬區細胞增殖率升高(P<0.05)。模型組在24，48，72 h細胞增殖率逐漸升高，但差異無統計學意義(P>0.05)，過表達組逐漸降低，沉默組逐漸升高(P<0.05)。見表1。

表1 各組大鼠不同時間點海馬區細胞增殖率比較

2.4海馬區細胞凋亡率的比較 與模型組相比，過表達組海馬區細胞凋亡率升高，沉默組海馬區細胞凋亡率降低(P<0.05)。與過表達組相比，沉默組海馬區細胞細胞凋亡率降低(P<0.05)。模型組在24，48，72 h細胞凋亡率逐漸升高，但差異無統計學意義(P>0.05)，過表達組逐漸升高，沉默組逐漸降低(P<0.05)。見表2。

表2 各組大鼠不同時間點海馬區細胞凋亡率比較

2.5Western blot檢測 與模型組相比，過表達組Bcl-2表達升高，Akt、Bax蛋白表達降低，沉默組Bcl-2蛋白表達降低，Akt、Bax表達升高(Akt、Bax表達升高不甚明顯)，具有統計學差異(P<0.05)。與過表達組相比，沉默組Bcl-2蛋白表達降低，Akt、Bax表達升高，差異有統計學意義(P<0.05)。見圖2。

3 討 論

miRNA屬于一種短非編碼調控RNA，在調控基因表達方面效果顯著。且可作為診斷癲癇潛在的生物標記因子[6-7]。miR-132屬于一種活性依賴RNA，在神經元具有高度保守性并且相關含量較為豐富。癲癇的發生主要與多種編碼電壓門控性鈉離子通道基因突變有關，其中主要集中在編碼鈉離子通道α亞基SCN1A、SCN2A和編碼β亞基的基因 SCN1B中發現[8]。SCN2A的基因突變與全面性癲癇伴熱性驚厥附加癥、良性家族性新生兒-嬰兒驚厥、兒童難治性癲癇有關[9]。L.Xia等[10]指出，miR-132表達水平與癲癇的發作有關。本研究結果顯示，沉默組與過表達組和模型組相比，SCN2A mRNA表達升高，說明沉默miR-132，能夠上調SCN2A mRNA表達。在體外細胞研究中顯示，抑制miR-132-3p，細胞中的SCN2A表達升高，證實miR-132-3p與SCN2A之間具有抑制關系。本研究結果顯示，沉默組在24，48，72 h細胞增殖率逐漸升高，并且與過表達組和模型組相比，各時間段海馬區細胞增殖率升高。說明沉默miR-132能夠促進海馬區細胞增殖。研究[11]指出，miR-132是一種抑癌基因,通過靶向調控相關因子對癌細胞增殖和凋亡起到抑制作用。本研究顯示，采用流式細胞儀檢測細胞凋亡，發現沉默組在24，48，72 h細胞凋亡率逐漸降低，與過表達組和模型組相比，其各時間段海馬區細胞凋亡率降低。說明沉默miR-132能夠抑制海馬區細胞凋亡。

miR-132誘發癲癇的途徑是通過影響影響突觸的結構和功能。Bcl-2屬于一種常見的抑癌蛋白，Bax屬于一種凋亡誘導基因，兩者結合以二聚體的形式存在，在細胞增殖和凋亡過程中發揮重要重要作用。A.Skardoutsou等[12]指出，Bcl-2與Bax基因結合產生二聚體，促進細胞凋亡。Akt是PI3K下游的靶蛋白，激活Akt能夠促進細胞生長，發揮抗凋亡作用。本研究結果顯示，沉默組與過表達組和模型組相比，Bcl-2蛋白表達降低，Akt、Bax表達升高。說明miRNA-132沉默通過抑制Bcl-2表達，促進Akt、Bax升高，從而抑制癲癇大鼠海馬區細胞增殖，抑制其凋亡。

綜上所述，miRNA-132沉默能夠增強SCN2A表達，miRNA-132通過靶向調控SCN2A，能促進癲癇大鼠海馬區細胞增殖，抑制其凋亡。為miRNA-132在癲癇中的臨床診斷和治療提供理論依據。(本文圖1,圖2見封三)