胞裂蛋白12基因啟動子多態性與漢族男性弱精子癥易感性的關系分析

王海旭 張建芳 王紅娜 翟倩 李硯

(中國人民解放軍空軍軍醫大學第一附屬醫院婦產科生殖中心，陜西 西安 710032)

近年來不孕不育的發病率不斷增長[1]，世界衛生組織報道[2]指出，中國不孕不育夫婦至少有1 000萬對，其中男性因素導致的不育占不孕不育夫婦的50%。弱精子癥是男性不育最常見的病因，臨床特征以精子活力異常、前向運動能力減弱為主，引起弱精子癥的病因多種多樣，但具體發病機制尚未有統一定論[3]。研究表明[4]，Septin(SEPT)是一類具有GTP 酶活性的細胞骨架基因家族，SEPT12基因是SEPT家族的成員之一，位于16 p13.3，在精子發生和成熟中發揮著重要作用。動物實驗研究[5]表明，SEPT12轉錄物缺失是造成雄性小鼠不育的重要因素，同時發現SEPT12在弱精子癥患者精子中顯著低表達。本研究主要通過調查弱精子癥患者精液標本中SEPT12基因表達水平，探討SEPT12基因多態性與弱精子癥易感性的關系。

1 資料與方法

1.1研究對象 選取2018年3月至2020年3月期間于我院就診的弱精子癥患者230例為弱精子癥組，入選標準：(1)按照第五版WHO公布的精液常規分析確診為弱精子癥；(2)常住西安的漢族人群；(3)就診前無高熱現象。排除標準：(1)合并重度精索靜脈曲張者；(2)染色體核型異常；(3)Y染色體AZF微缺失；(4)睪丸炎、生殖器外傷者。另選取同期采集的正常精液標本為對照組(n=200)。本研究已通過我院醫學倫理委員會批準。

1.2方法 患者采集標本前需禁欲3～7 d，確保所有精液完全射入取精杯中，37℃恒溫水箱中水浴30 min，完全液化后，經40%和80%Percoll非連續密度梯度液分離，取80%Percoll液底部的精子，離心分離純化精子后，置于-80℃冰箱中保存待測。取出標本置于冰上溶解，提取RNA，進一步反轉逆錄成cDNA，采用熒光定量PCR技術檢測精子SEPT12基因表達，針對SEPT12基因rs759991 位點設計特異性引物，引物序列上游5’-GTACAAAGTACACGCAGCAGTGC’，下游5’-ATCACCCGCCAGCGCCACAT’，交由上海生工生物工程有限公司合成后，待反應完成后送往公司進行測序。

2 結 果

2.1兩組臨床資料比較 弱精子癥組前向運動精子百分率明顯低于對照組(P<0.001)。見表1。

表1 兩組臨床資料比較

2.2SEPT12基因Hardy-Weinberg遺傳平衡檢驗 兩組SEPT12各基因型頻率分布無顯著差異(P>0.05)，符合Hardy-Weinberg遺傳平衡。見表2。

表2 SEPT12基因Hardy-Weinberg遺傳平衡檢驗[n(%)]

2.3SEPT12基因rs759991位點基因型的分布頻率 弱精子癥組SEPT12基因rs759991位點TT基因型頻率高于對照組(P<0.05)，CC、CT基因型在兩組間的分布頻率無顯著差異(P>0.05)。見表3。

表3 SEPT12基因rs759991位點基因型的分布頻率[n(%)]

2.4SEPT12基因rs759991 位點等位基因頻率 弱精子癥組C等位基因頻率明顯低于對照組，T等位基因頻率高于對照組(P<0.05)。見表4。

表4 SEPT12基因rs759991位點等位基因頻率[n(%)]

3 討 論

近年來多數學者提出某些遺傳基因的突變是引發弱精子癥的重要致病因素，有研究[6]表明，單核苷酸多態性在疾病的遺傳機理中發揮著重要作用，會對蛋白質結構或表達水平產生一定影響。Septins是一個聚合GTP結合蛋白家族，定位于精子鞭毛環結構，精子尾部鞭毛(sperm flagella)是保障精子維持活力的主體結構[7]。SEPT12基因屬于SEPT家族成員，而SEPT12基因rs759991位點位于該基因第5號外顯子。哺乳動物中精子向前運動主要靠精子尾部鞭毛擺動，任何精子尾部的形態和結構異常均會導致精子運動障礙、精子活力改變，Y.H.Lin等[8]研究發現，SEPT12基因rs759991位點TT基因型個體的精子頸環和尾部結構存在異常，精子DNA損傷明顯增加，提示SEPT12基因rs759991位點多態性與男性不育存在相關性。Y.R.Shen等[9]研究發現，SEPT12Ser198位于保守的G結構域中，采用Ser198磷酸化通過消除SEPT12與SEPT17的關聯進而破壞SEPT12細絲，導致精子環的缺失、結構異常和活性下降。相關序列分析結果顯示[10]，rs759991位點C/T的改變會增加一個新的剪接點，進而導致5號外顯子3’端41lb的缺失同時在6號外顯子出現一個新的的密碼子，出現一種C末端缺失的SEPT12蛋白，GTP結合結構域缺失，影響蛋白結構和功能，進而影響精子活力。

本研究結果顯示，弱精子癥組SEPT12基因 rs759991 位點TT基因型頻率高于對照組；弱精子癥組T等位基因頻率高于對照組，分析原因可能是SEPT12基因 rs759991 位點TT基因型個體的精子頸環結構發生改變，增加DNA損傷程度，影響線粒體分布和數量，而線粒體是為精子提供三磷酸腺苷的重要前提，進而影響精子活力，造成弱精子癥的發生。

綜上所述，SEPT12基因 rs759991 位點與漢族男性弱精子癥的發生存在相關性，攜帶TT基因型的個體可能會增加弱精子癥的患病風險，值得進一步深入探討其作用和調控機制。