原發傳染性單核細胞增多癥患兒血清sHLA-G水平與EBV-DNA載量的相關性分析

幸紅軍,朱明路

遼寧省沈陽市第四人民醫院檢驗科，遼寧沈陽 110031

原發傳染性單核細胞增多癥是一種急性自限性傳染病，主要是由EB病毒(EBV)感染所致，發病后可出現典型的三聯征，表現為發熱、咽峽炎、淋巴結腫大等，多發于學齡前和學齡兒童，尤其是嬰幼兒[1]。多數患兒預后較為良好，但也有部分患兒容易出現噬血綜合征等嚴重并發癥，影響預后。臨床上針對該病的診斷主要通過血常規、EBV抗體檢查、EBV-脫氧核糖核酸(EBV-DNA)檢測等確診，但在實踐中發現，不同患兒對EBV感染的反應不同，出現差異的原因與宿主的免疫反應不同有密切聯系[2]。可溶性白細胞抗原G(sHLA-G)是機體重要的免疫抑制分子，目前有報道證實，當機體被病毒感染后，sHLA-G可在血漿中持續性高表達，并對病毒逃逸宿主免疫系統的攻擊具有重要的監視作用[3]。但目前關于其在原發傳染性單核細胞增多癥患兒中的相關報道仍較少。本研究旨在探討原發傳染性單核細胞增多癥患兒血清sHLA-G水平與EBV-DNA載量的相關性，現報道如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 選擇2016年4月至2019年4月本院接診的60例原發傳染性單核細胞增多癥患兒作為觀察組。納入標準：(1)符合原發傳染性單核細胞增多癥診斷標準[4]，并通過臨床癥狀、血常規、異型淋巴細胞計數、EBV抗體、EBV-DNA等檢查得以確診；(2)年齡3個月至3歲。排除標準：(1)先天畸形者；(2)臟器功能嚴重障礙者；(3)惡性腫瘤者；(4)近期接受過相關治療者；(5)已出現并發癥者；(6)近3個月內使用過激素、免疫抑制劑或增強劑者；(7)無法配合本研究者。并選擇同期本院兒科健康體檢兒童60例作為對照組，本組兒童近半年內未發生病毒感染，年齡3個月至3歲。所有受試者家屬均知情同意本研究，并簽署知情同意書。本研究通過本院倫理委員會審核。

1.2方法

1.2.1一般資料收集 收集所有受試者性別、年齡、身高、體質量等一般資料。

1.2.2血清sHLA-G水平檢測 收集兩組受試者清晨空腹靜脈血5 mL，加入乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝管，混勻后靜置30 min，于室溫下以3 000 r/min的速度離心10 min，置于冷凍箱內儲存以備檢測。使用酶聯免疫吸附試驗(ELISA)進行檢測，試劑盒購于捷克Exbio公司。

1.2.3EBV-DNA載量檢測 將靜脈血置于枸櫞酸鈉抗凝管中，使用TaqMan熒光標記探針基因擴增技術(序列為PEEBV5′-XC-CTCGGA-CAGCTCCTAA-GAA GG-CACC-Y-3′，26 bp)進行檢測。將各反應管置于實時熒光定量聚合酶鏈反應(RT-PCR)檢測儀(DA7600型)中，通過下列條件進行擴增：分別在若干PCR反應管中加入處理后的2 μL樣品上清液，以8 000 r/min的速度離心數秒置入RT-PCR檢測儀樣品槽中，按對應的順序放置陰性質控品、陽性定量參考品和準備檢測的標本。于93 ℃的環境下，預變性2 min，再變性45 s后在55 ℃的環境下變性45 s，反復進行30個循環。試劑盒購于中山大學達安基因股份有限公司。

1.2.4T淋巴細胞亞群檢測 將收集至EDTA抗凝管的靜脈血各取100 μL，分別加入帶有相應熒光抗體20 μL的試管中，搖勻后于室溫下避光保存15 min，使用標本制備儀進行自動溶血、固定，采用美國Beckman Coulter公司生產的流式細胞儀(EPICS-XL型)進行檢測，檢測指標包括CD3+、CD4+、CD8+、CD4+/CD8+。

2 結 果

2.1兩組一般資料、血清sHLA-G水平和EBV-DNA載量比較 兩組性別、年齡、身高、體質量比較，差異無統計學意義(P>0.05)，觀察組血清sHLA-G水平和EBV-DNA載量均明顯高于對照組(P<0.05)，見表1。

表1 兩組一般資料、血清sHLA-G水平和EBV-DNA載量比較

2.2兩組T淋巴細胞亞群比較 觀察組CD3+、CD8+明顯高于對照組(P<0.05)，CD4+、CD4+/CD8+明顯低于對照組(P<0.05)，見表2。

2.3血清sHLA-G水平與EBV-DNA載量、T淋巴細胞亞群的相關性分析 Pearson相關分析顯示，血清sHLA-G水平與EBV-DNA載量呈正相關(r=0.483，P<0.05)，與T淋巴細胞亞群CD3+、CD4+、CD8+、CD4+/CD8+均無相關性(r=0.029、-0.022、0.017、-0.084，P>0.05)。

表2 兩組T淋巴細胞亞群比較

3 討 論

EBV-DNA載量檢測是目前診斷原發傳染性單核細胞增多癥患兒的重要手段，其可動態反映EBV感染后的病毒水平，且有助于避免單一檢測易受體液免疫影響的弊端，結果準確，已普遍應用于該病的診治，具有重要的應用價值[5]。近年來，諸多學者開始關注細胞免疫狀態在原發傳染性單核細胞增多癥患兒中的表達及意義，并認為其在EBV感染過程中有著重要作用[6]。B淋巴細胞是EBV感染的重要靶細胞，B淋巴細胞在被EBV攻擊后可發生改變，干擾機體的正常免疫機制，病毒長時間于細胞內潛伏，在一定條件下通過病毒基因、編碼產物等途徑對細胞基因產生影響，誘發疾病[7]。KALRA等[8]的研究顯示，原發傳染性單核細胞增多癥患兒的臨床癥狀與淋巴細胞活化具有密切關聯，該病的發生可能和免疫抑制相關，而不是病毒復制直接誘發的。

sHLA-G是機體重要的免疫抑制分子，其可通過各種途徑對CD4+、CD8+等各類免疫細胞的功能產生影響。目前已有研究證實，sHLA-G對T淋巴細胞的殺傷功能、NK細胞的殺傷效應、Th細胞的輔助功能、細胞因子的釋放等具有抑制作用，而此類功能被抑制也是病毒逃避細胞免疫的機制[9]。本研究結果也顯示，在原發傳染性單核細胞增多癥患兒中，sHLA-G水平明顯高于健康兒童，提示在該病患兒中存在著免疫抑制表現。

T淋巴細胞亞群中，CD3+是反映T淋巴細胞活化程度的指標，CD4+是Th細胞和效應T淋巴細胞的表面標志物，Th細胞可通過釋放多種細胞因子促進B淋巴細胞、效應T淋巴細胞的激活，加強機體免疫功能，而CD4+/CD8+則是反映機體免疫功能高低的重要指標[10]。本研究結果顯示，在原發傳染性單核細胞增多癥患兒中，CD3+、CD8+明顯升高，CD4+、CD4+/CD8+明顯降低，提示患兒被EBV感染后，存在著明顯的T淋巴細胞亞群紊亂表現，機體處于免疫紊亂狀態。本研究通過相關性分析發現，血清sHLA-G水平與EBV-DNA載量呈正相關，分析患兒被EBV感染后，病毒可侵入細胞并發揮作用，對機體的正常免疫機制產生干擾，導致EBV-DNA載量的升高。但血清sHLA-G水平與T淋巴細胞亞群CD3+、CD4+、CD8+、CD4+/CD8+均無相關性，提示血清sHLA-G的高表達和原發傳染性單核細胞增多癥患兒的免疫功能狀態無關，sHLA-G并不直接影響患兒的免疫功能。閆臨漪等[11]研究也顯示，血清sHLA-G可能是和其他因素之間相互協同致使原發傳染性單核細胞增多癥患兒的免疫功能減弱。筆者認為也有可能是本研究納入的患兒年齡過小，免疫系統尚未發育完善等因素所致，今后仍需擴大樣本量繼續研究。

綜上所述，血清sHLA-G水平在原發傳染性單核細胞增多癥患兒中明顯升高，且和EBV-DNA載量具有相關性，但血清sHLA-G水平的升高并不是造成患兒免疫功能降低的直接因素。