基于高通量測序探索三伏貼對特稟質人群腸道微生物影響

周 潔，周幫旻，嘉士健，雷行華，寇瀟月，陳麗妹，曾德軍，袁菱梅，吳賢波

中醫體質學以中醫理論為基礎，以分類提煉、快速評估健康信息的方法，對人群進行中醫體質分類，并制定針對性的干預措施，以預防及治療疾病。其中，由王琦[1]提出的9種體質學說應用最為廣泛。特稟質為其中之一，該體質人群易患哮喘、鼻炎、蕁麻疹等過敏性疾病，對外界環境適應能力差[2]。目前，從中醫體質分類角度對特稟質的基礎及臨床研究較少，更多是從西醫角度針對過敏性疾病的研究。

腸道微生物作為人體中最龐大的微生物群，對過敏反應起著至關重要的調節作用，也是目前研究過敏反應的重要方向[3-8]。因此，可用腸道微生物的變化作為突破口為特稟質人群的生理病理改變尋找生物學基礎。目前，基因測序是獲得腸道微生物信息最為流行的檢測手段，尤其是高通量測序。為探索三伏貼對特稟質人群的的影響及其生物學基礎，本研究基于高通量測序的方法，對受試者腸道微生物的16S rDNA的V3-V4可變區域進行擴增測序，比較三伏貼前后特稟質受試者腸道微生物變化，觀察三伏貼對特稟質受試者腸道微生態的影響。

1 對象與方法

1.1 病例資料 研究對象均來自2018年成都市新都區中醫醫院門診患者。研究通過成都市新都區中醫醫院倫理審查（2018-01）。納入標準：年齡18～65周歲，性別不限；根據《中醫體質分類與判定》標準判定體質，體質辨識結果為特稟質轉化分≥40分則納入試驗組（特稟質人群），平和質轉化分≥60分且其他8種體質轉化分均＜30分納入對照組（平和質人群，即健康人群）[9]；受試者簽署知情同意書。排除標準：有急慢性腸道疾病，需長期或間斷服用藥物者；有嚴重原發性疾病長期服用藥物者；近期1個月內未接受過抗生素及微生態制劑治療；近3個月內參加過其他臨床試驗者。

根據研究方案招募20例受試者，其中試驗組10例，對照組10例，其基本資料見表1，兩組年齡、性別比較無統計學差異(P＞0.05)。試驗中，特稟質受試者1例因懷孕脫落，平和質受試者1例因失訪脫落、1例要求退出試驗。試驗過程中未發生不良事件。

表1 兩組受試者基本資料比較

1.2 研究方法 采用自身對照的方法，對試驗組連續兩年貼敷三伏貼，對照組不接受任何干預。分別采集分析兩組受試者2018年7月初伏前及2020年12月的清晨大便標本和中醫體質得分。

1.3 三伏貼組方制備 組方為成都市新都區中醫醫院制劑室根據該院臨床處方經驗及文獻自主配方，已在臨床應用9年[10-11]。藥物組成為延胡索、白芥子、甘遂、細辛等，按比例研成粉末，用新鮮姜汁調成膏狀，制作成直徑約1 cm、厚度約2 mm的藥餅，用穴位貼敷固定貼固定在穴位上。

1.4 干預過程 （1）貼敷穴位：肺俞、脾俞、腎俞、膈腧（均為雙側）；（2）貼敷時間：2018、2019年農歷“三伏”每伏的第1 d各貼1次，共6次，每次貼敷4 h；（3）觀察反應：密切觀察藥物反應，記錄并及時處理不良反應。

1.5 高通量測序過程及方法 使用無菌大便采集器采集受試者清晨大便標本約2 g，立即密封并放至干冰（-20°）中保存，送蘇州金唯智生物科技有限公司進行基因測序、分析。提取糞便樣本中細菌總DNA后，對16S rDNA V3-V4區進行擴增子測序，測序平臺為Illumina MiSeq(Illumina,San Diego,CA,USA)，對測序后得到的原始序列片段進行拼接、去除嵌合體序列后得到有效序列，并在97%閾值的相似度上進行操作分類單元（OTU）分析、物種分類學分析（比對數據庫為Silva_132 16S rRNA database），得到各個樣本的腸道菌群的物種特征（包括物種名稱、絕對豐度、相對豐度）。使用α多樣性分析、β多樣性分析描述腸道微生物的多樣性特征，使用Metastats分析描述腸道微生物門水平和屬水平的群落構成差異，使用LEfSe（LDA Effect Size）分析尋找起重要作用的特異性微生物類群（biomarker）[12-13]。

2 結果

2.1 體質得分比較 試驗組貼敷兩年三伏貼后，特稟質得分降低，平和質得分升高，特稟質相關癥狀得到改善（表2）。

表2 特稟質受試者兩年前后體質轉化分比較(?s)

表2 特稟質受試者兩年前后體質轉化分比較(?s)

注： 與2018年7月比較,①P ＜ 0.05

組別 取樣時間 特稟質得分 平和質得分試驗組2018年7月 53.18±9.85 60.76±16.18（n=9) 2020年12月 34.13±8.59? 72.92±6.99?

2.2 腸道微生物檢測結果

2.2.1 測序質量 從稀疏曲線（圖1）可以看出，當測序達到一定深度時，各個樣本的稀疏曲線均趨于平緩，說明該研究的測序工作足夠充分，測序質量可靠，每個樣本的序列數量足以檢測樣本中存在的大多數物種。

圖1 各樣本稀疏曲線

2.2.2 α多樣性分析 選擇α多樣性中的Simpson指數和Shannon指數對菌落物種組成的豐度及均勻度進行綜合評價，干預前，兩組受試者腸道微生物的Simpson指數和Shannon指數均無統計學差異（P＞0.05）。2020年對照2018年，兩組受試者的Simpson指數和Shannon指數均無改變（P＞0.05）。尚不能認為三伏貼貼敷對特稟質受試者的腸道微生物的豐度及均勻度有影響。

2.2.3 β多樣性分析 通過PCoA分析（圖2）發現，兩組受試者2018年各樣本的坐標分布走向相似，說明兩組的腸道微生物的多樣性相似。兩組受試者2020年樣本的坐標分布走向相似，尚不能說明三伏貼能夠影響特稟質人群的腸道微生物多樣性。

圖2 各樣本的PCoA分析

2.2.4 腸道微生物群落結構及組間差異比較受試者的腸道微生物共檢測出9個菌屬：Bacter oidetes（擬桿菌屬）、Firmicutes（厚壁菌屬）、Proteob acteri a（變形菌屬）等。2018年，兩組受試者屬水平群落結構無顯著差異，優勢菌屬均為Bacter oidetes、Firmicutes，兩個菌屬總相對豐度占比＞90%。2020年兩組受試者優勢菌屬不變，兩個菌門總相對豐度占比均為89%。

在菌屬水平上對兩受試者2018腸道微生物進行組間比較差異無統計學意義。相對豐度＞0.01的菌屬，2020年對照2018年，兩組受試者的Bacter oides和Alistipes相對豐度均下降，Blautia相對豐度上升；試驗組的Parabacteroides、Parasutterella相對豐度下降（對照組的Faecalibacterium相對豐度上升，Sutt erella相對豐度下降），見表3、4。

表3 試驗組兩年前后腸道微生物相對豐度＞0.01的菌屬比較(?s)

表3 試驗組兩年前后腸道微生物相對豐度＞0.01的菌屬比較(?s)

Taxon 2018年 2020年 P Alist ipes 0.0354±0.0113 0.004±0.0016 0.006 Bacteroides 0.4588±0.0849 0.0527±0.0249 0.001 Blautia 0.0141±0.0034 0.1051±0.0422 0.010 Parabacteroides 0.0175±0.0069 0.0015±0.0006 0.007 Parasutter ella 0.0106±0.0036 0.0005±0.0003 0.007

表4 對照組兩年前后腸道微生物相對豐度＞0.01的菌屬比較(?s)

表4 對照組兩年前后腸道微生物相對豐度＞0.01的菌屬比較(?s)

Taxon 2018年 2020年 P Alistipes 0.0374±0.012 0.0050±0.0027 0.011 Bacteroi des 0.3649±0.0787 0.0546±0.0249 0.003 Blautia 0.0160±0.0048 0.0918±0.0339 0.011 Faecalibacterium 0.0610±0.0171 0.1434±0.0302 0.024 Sutterella 0.0101±0.005 0.0002±0.0002 0.023

2.2.5 LEfSE分析 圖3為受試者兩年前后腸道微生物基于LeFse分析的物種聚類進化樹圖。其中，黃色節點表示在各組中均未起到重要作用的微生物類群，其他顏色圓點表示在該著色組別中起到重要作用的微生物類群（biomarker）。2018年，實驗組在厚壁菌門（Firmicutes）和放線菌門（Proteobacter ia）均有b iomarker，而對照組沒有。2020年，兩組受試者在屬水平上的biomarker不同，試驗組為Blautia、Sellimonas、But yrici coccus、Rumi nococcacesa_UCG、Subdoligranoul um，對照組為Parvimonas、Ambiguous_taxa、Tyzzer alla_3。

圖3 基于LeFse分析的物種聚類進化樹

3 討論

3.1 特稟質和平和質受試者的腸道微生物多樣性比較無顯著差異，biomarker有顯著差異 本研究發現，特稟質和平和質受試者的腸道微生物多樣性（α多樣性和β多樣性）無顯著差異，且各個菌屬、菌屬的群落結構也沒有差異。但LeFSEf分析發現，特稟質受試者在厚壁菌屬（Firmicutes）和放線菌屬（Proteobacteria）均有biomarker，平和質受試者沒有。既往研究表明，過敏性疾病患者的腸道微生物多樣性與健康人無顯著差異，但菌屬的相對豐度有顯著差異[1，5-6]。同樣是過敏疾病患者，研究結果不同，這是因為多數針對過敏疾病的研究均是在受試對象正在發生過敏反應的急性期進行，而特稟質是一種非穩態的體質，它代表的是一種既往發生過過敏反應或有過敏傾向的狀態，更多地描述的是一種患病傾向而非病理過程，在參與研究的過程中，不一定處于過敏反應急性期。既往研究提示不同體質的人群其腸道微生物具有特異性表現，如陽虛質、痰濕質人群與平和質人群對比，其腸道微生物均有各自的特征，主要表現為群落結構的不同[14-17]。而研究發現，特稟質受試者與平和質受試者腸道微生物的群落結構相同，但biomarker生物標記不同。

3.2 三伏貼可以改善特稟質受試者的健康狀態，可能與調節腸道微生物有關 三伏貼可以改善特稟質受試者的健康狀態，降低其特稟質得分，提高其平和質得分，其療效可能與調節腸道微生物有關。特稟質受試者經過兩年三伏貼干預后，腸道微生物α多樣性無改變，其腸道微生物β多樣性的變化趨勢與平和質組兩年前后的變化趨勢一致，三伏貼不影響特稟質受試者的腸道微生物多樣性。在腸道微生物屬水平群落結構方面，特稟質受試的變化與平和質受試者不同，三伏貼影響了特稟質受試者腸道微生物屬水平的群落結構。此外，LEfSE分析結果發現三伏貼干預特稟質受試者后，其腸道微生物中的biomark er發生改變，且與平和質受試者不同。該研究通過高通量測序分析三伏貼干預兩年后特稟質受試者的腸道微生物變化后，尚未發現腸道微生物的多樣性有變化，但其屬水平的群落結構及biomarker有變化。三伏貼改善特稟質受試者體質狀態，可能與其腸道微生物屬水平群落結構及biomarker有關。