青霉胺結晶熱力學及拆分工藝研究

王東博，張蕾蕾，翟晶煥，張麗娟，劉錫建，朱雪焱，陸杰

（1 上海工程技術大學化學化工學院，上海201620； 2 中國醫藥工業研究總院化學制藥部，上海201203）

引 言

目前，超過50%的藥物活性成分具有手性[1]，由于生物體內的受體或酶是手性的，往往只有一種對映體藥物能夠與其選擇性地作用，進而提供所需的生理效應[2]，而另一種對映體則沒有這種相互作用，甚至是有害的[3]。例如，20 世紀60 年代的“反應?！笔录忱劝返谋瘎。渖忱劝稲 構型對孕婦具有鎮靜作用，而S 構型具有強烈的胎兒致畸作用，但市面上銷售的是沙利度胺的外消旋體，導致全世界數萬畸形兒的誕生，這起事件引起了科學家對藥物手性純度的重視[4]。本實驗研究的青霉胺（penicillamine，Pen）雖然構型相似，但藥理作用完全相反。其中，D-青霉胺是一種重要的硫醇類化合物，臨床上可用于治療Wilson 氏病，亦可用作銅、汞等重金屬解毒藥[5]。近年來，研究還發現它能夠用于治療類風濕性關節炎和肝炎，以及預防嬰幼兒視網膜等疾病[6]。然而，L-青霉胺卻有相當大的毒性，對人體有毒害作用[7]。

結晶拆分法即通過結晶的方式，使得外消旋溶液中某一種對映異構體結晶析出，而另一種對映異構體仍留在溶液中，從而達到手性拆分的目的，一般包括非對映體成鹽拆分[8-9]、優先結晶[10-12]、優先富集[13-14]、Viedma 熟化[15-17]等。其中，優先結晶法又稱直接結晶法，具有簡單、高效及便捷等特點，是一種重要的拆分手性異構體的方法，即向外消旋體的過飽和溶液中加入某一純的對映體作為晶種，僅使該對映體的晶體從溶液中析出的方法[18-20]。

近年來，一些學者對青霉胺的手性分離進行了研究。Nakashima 等[21]、He 等[5]分別采用高效液相色譜和毛細管電泳法拆分其外消旋體。雖然其拆分方法能夠獲得較高純度的單一對映體，但方法煩瑣不能用于實際的工業生產。另外，國家對工業生產過程中的環境保護工作高度重視[22-23]，因此開發環保、高效、便捷及能夠實現工業化生產的結晶拆分技術，對D-青霉胺的實際生產與臨床應用具有重要意義。

本項研究首先測定了DL-及D-青霉胺在273.15～333.15 K、不同質量比的乙醇-水混合溶劑中的溶解度，以此選定質量分數為34.47%乙醇-水作為降溫結晶溶劑，并繪制不同溫度下青霉胺溶解度曲線。結果表明其二元共飽和點的對映體過量值（ee值）為85%。隨后，以313.15 K下、ee值為87%的飽和溶液為模型體系，研究了其在0.3 K/min、不同晶種量下的介穩區寬度（metastable zone width,MSZW），以及不同初始過冷度下的等溫結晶過程和不同降溫速率、不同晶種量的降溫結晶過程，為青霉胺結晶拆分過程的理解、優化、工藝設計提供基礎。

1 實驗材料和方法

1.1 實驗材料

D-青霉胺、L-青霉胺與DL-青霉胺（純度＞98%），北京百靈威科技有限公司；乙醇（純度＞99.7%），麥克林試劑；超純水，上海樂楓生物科技有限公司Direct-Pure系統。

1.2 實驗設備

低溫恒溫槽，F12-ME 型，德國優萊博公司；高效液相色譜儀（配有四元泵及自動進樣器，DAD 檢測器），1260 型，美國安捷倫公司；電子天平，XP 205型，梅特勒托利多集團；真空干燥箱，DZF-6050 型，上海慧泰儀器制造有限公司；熱重分析儀，TGA PT-1000型，林賽斯（上海）科學儀器有限公司；X射線衍射儀，D2 PHASER 型，德國布魯克公司；激光發射器、接收器等相關組件由西安賽普林激光技術研究所制造。

1.3 實驗方法

1.3.1 固液平衡 室溫下準確稱量一定量的乙醇和超純水置于某恒定溫度的結晶器中，加入過量DL-青霉胺、D-青霉胺或不同初始ee 值青霉胺，恒溫攪拌12 h，并靜置6 h（在此項工作中利用激光檢測系統在線監測溶液濁度變化情況。當攪拌6 h 后激光強度變化緩慢，當靜置3 h 時后激光強度達到極大值并趨于穩定），注射器抽取上清液，用0.22 μm 的膜過濾器過濾后注入小瓶中，烘干，稱重，用式（1）計算摩爾分數溶解度x[24-27]。殘留固體分析其ee值、溶劑化以及晶型改變與否。

式中，m1、m2、m3分別表示青霉胺、去離子水、乙醇在飽和溶液中的質量，M1、M2、M3分別表示各自的摩爾質量。

1.3.2 介穩區寬度 D-青霉胺、DL-青霉胺以及ee值為87%溶液的介穩區寬度用激光檢測法測定：根據溶解度曲線準確稱取溶質與溶劑，放入結晶器后，將恒溫水浴溫度設置比飽和溫度高5 K，攪拌2 h，待溶液穩定后，以0.3 K/min 恒定降溫速率降溫，待激光強度開始變弱，溶液變渾濁時記錄溶液溫度，此溫度與飽和溫度之差就是所測的介穩區寬度。

1.3.3 成核實驗 配制ee 值為80%、87%、90%和95%在313.15 K 下的飽和溶液，分別快速移入溫度已恒定在303.15、298.15、293.15、288.15 和283.15 K的結晶器中，當激光強度開始變弱，溶液渾濁時分析固體ee值。

1.3.4 恒溫結晶 配制ee 值為87%在313.15 K 下的飽和溶液，移入溫度已恒定在307.15、303.15、298.15 或293.15 K 的結晶器中，晶種量為無、1%、2%、4%或8%（相對于起始飽和溶液中D-青霉胺的量），以結晶時間間隔30 min 分析產品ee 值，并確定產品ee 值始低于99%的時間點及在該時間點下結晶收率（產品質量減去晶種加入量后與原料液中D-對映體的質量之比）。

1.3.5 降溫結晶 配制ee 值為87%在313.15 K 下的飽和溶液，降溫速率分別為0.05、0.1、0.2 和0.4 K/min，晶種量為1%、2%、4%或8%，以結晶時間間隔20 min 分析產品ee 值，并確定產品ee 值始低于99%的時間點及在該時間點下結晶收率。

1.3.6 高效液相色譜分析 采用高效液相色譜（HPLC）測量ee 值。色譜條件：大賽璐CR(+)手性色譜柱（4.0 mm×150 mm，5 μm），流動相為pH=1 的高氯酸-水溶液，流速為0.1 ml/min，柱溫15℃，檢測波長λ=202 nm，進樣量5 μl。

2 實驗結果與討論

2.1 DL-和D-青霉胺在不同質量比乙醇-水混合溶劑中的溶解度

乙醇質量分數分別為0、16.21%、34.47% 和52.09%的乙醇-水混合溶劑中DL-及D-青霉胺在273.15～333.15 K 溫度范圍內的溶解度如圖1所示。

圖1 DL-和D-青霉胺在不同質量比乙醇-水混合溶劑中的溶解度Fig.1 Solubility of DL-and D-penicillamine in ethanol-water mixed solvents with different mass ratios

圖2 D-和DL-青霉胺殘余固體的熱分析譜圖Fig.2 DSC and TGA thermograms of the residual solids of D-and DL-penicillamine

圖3 D-和DL-青霉胺原料與固液平衡后殘余固體的X射線衍射譜圖Fig.3 XRD patterns of the raw materials and the residual solids after solid-liquid equilibrium of D-and DL-penicillamine

研究發現，在實驗的溫度范圍下，D-及DL-青霉胺殘余固體的熱分析譜圖如圖2 所示，其原料與殘余固體的X 射線衍射光譜如圖3 所示，從圖中可發現殘余的固體無溶劑化及晶型改變現象。溶解度單調地隨溫度的升高而增大，且DL-青霉胺溶解度小于D-青霉胺溶解度，說明青霉胺外消旋體類型可能是外消旋化合物。此外，在純水中，DL-及D-青霉胺溶解度非常大（293.15 K時，DL-和D-青霉胺摩爾溶解度分別為6.863×10-3和15.589×10-3），且隨著混合溶劑中乙醇含量的增加，溶解度降低。

2.2 不同ee值青霉胺的溶解度

在乙醇質量分數為34.47%的乙醇-水混合溶劑中，273.15、283.15、293.15、303.15、313.15 和323.15 K六個固液平衡溫度下不同ee值青霉胺的溶解度如圖4所示。結果顯示，在六個溫度下，二元共飽和點ee 值不發生變化，始終為85%。六個溫度下的溶解度曲線形狀類似，可進一步證明青霉胺外消旋體為外消旋化合物[28]。

圖4 不同ee值青霉胺的溶解度Fig.4 The solubility of penicillamine with various ee values

2.3 D-青霉胺、DL-青霉胺以及ee 值為87%溶液的介穩區寬度

在乙醇質量分數為34.47%的乙醇-水混合溶劑中不同溫度下的D-青霉胺、DL-青霉胺及ee 值為87%飽和溶液的介穩區寬度如圖5 所示。介穩區寬度隨溫度升高而減小，主要是因為在高溫下溶液黏度降低，溶質擴散系數增大，分子熱運動加劇，成核較低溫時更容易，在實驗溫度范圍內，相同飽和溫度下的D-青霉胺溶液的介穩區寬度比外消旋體溶液的介穩區寬度寬[29]。ee 值為87%、溫度為313.15 K 的飽和溶液在不加晶種時，其介穩區寬度為17.6 K；加入1%、2%、4%和8%晶種時，其介穩區寬度分別為16.4、15.3、13.0 和8.3 K。介穩區寬度隨晶種加入量的增加而減小，這可能是由于加入的晶種降低了初級成核勢壘，成核更容易，介穩區寬度減小。

2.4 成核實驗

圖5 D-青霉胺、DL-青霉胺和ee=87%飽和溶液的介穩區寬度Fig.5 The MSZW of D-penicillamine,DL-penicillamine and saturation solution with ee=87%

圖6 過冷度對初始成核的影響Fig.6 Effect of subcooling on initial nucleation

313.15 K下不同ee值的飽和溶液在不同成核溫度下的初始晶核的ee 值如圖6 所示。成核溫度越低、初始過冷度越大，晶核量越多，ee 值越小。反之，成核溫度越高，初始過冷度越小，晶核量越少，ee值越大。如ee 值為87%、飽和溫度為313.15 K 的飽和溶液[圖6(b)]，在283.15 K 成核時，晶核的ee 值為86.84%；在303.15 K成核時，晶核的ee值為89.23%。也就是說，對于青霉胺手性體系可通過優先結晶法提高產品ee值。

2.5 恒溫結晶

2.5.1 不加晶種 ee 值為87%、313.15 K 下的飽和溶液在初始過冷度為6、10、15 和20 K 時固體ee 值隨結晶時間的變化情況如圖7所示。在四個恒定溫度下，初始晶核的ee 值均大于87%，產品ee 值隨時間先增大后減小，但增大過程的時間隨結晶溫度變化較大，例如ee 值增加趨勢在293.15 K 下僅維持約2 min，而在307.15 K 下能維持約40 min。也就是說，初始晶核中D-對映體晶核比外消旋體晶核多，在其生長過程中，隨著過飽和度的消耗，外消旋體晶體逐漸增多。

圖7 固體ee值隨結晶時間的變化Fig.7 Change of the ee value of solids with crystallization time

2.5.2 加晶種 ee 值為87%、313.15 K 下的飽和溶液在初始過冷度為6、10、15 和20 K 以及晶種量為1%、2%、4%和8%時固體ee值隨結晶時間變化情況如圖8 所示。與2.5.1 節不加晶種實驗相比，加入晶種后，固體產品的ee 值隨結晶時間單調地降低。在同樣晶種加入量下，固體ee 值下降速度隨初始過冷度的增加而增大。正如前文所述，晶種為1%、2%、4%和8%時，該飽和溶液介穩區寬度分別為16.4、15.3、13.0 和8.3 K。當采用過大的初始過冷度（如10、15 和20 K），加入的晶種量越多，誘導成核的速率和晶核量越高，產品ee 值越小且快速下降。當初始過冷度為6 K時，晶種量為2%的結晶產品ee值隨時間變化最為緩慢。這是因為在該初始過冷度下，晶種量較大時，成核發生加快，晶核量增多，產品ee值較快下降；而晶種量較小如1%時，不足以誘導二次成核，且晶種提供的生長面較少，誘導期后的初級成核速率較大，產品ee 值相應下降較快。因此，結晶拆分應選擇適宜的過飽和度及與其相應的晶種量。

2.5.3 結晶收率 按照2.5.2 節的實驗結果重復實驗并分析固體ee值始低于99%時間點時產品收率，結果如表1所示。產品收率隨晶種加入量和初始過冷度的增大而增大。在實驗采用的初始過冷度中，隨初始過冷度的增加，收率增加逐漸變緩，這主要是因為初始過冷度較大時，產生的晶核較多，產品粒度較小。

2.5.4 過程分析 以初始過冷度為10 K、晶種量為2%為例，固體和母液ee值隨時間變化情況如圖9所示。固體ee 值在前300 min 緩慢減小，超過300 min后迅速下降。母液ee 值在前300 min 一直減小，說明D-對映體晶體和外消旋體晶體從母液中以不同速率析出，并逐漸變緩，超過300 min 后外消旋體晶體大比例析出，產品ee 值快速下降，母液ee 值快速上升，最終趨向于二元共飽和點ee 值。根據母液ee值變化繪制的結晶過程路線“trajectory”如圖10 所示[30]，溶液ee值先快后慢減小，到達拐點后逐漸增大至二元共飽和點ee值。

表1 青霉胺恒溫結晶收率Table 1 Yield of penicillamine of thermostatic crystallization

圖8 固體ee值隨時間變化曲線Fig.8 Curve of solid ee values over time

圖9 結晶過程中固體和母液ee值變化Fig.9 Change in ee value of the solid and mother liquor during crystallization process

2.6 降溫結晶

圖10 青霉胺恒溫結晶過程Fig.10 The thermostatic crystallization process of penicillamine

2.6.1 過程分析 ee 值為87%、313.15 K 下的飽和溶液在晶種量為1%、2%、4%和8%以及降溫速率為0.05、0.1、0.2 和0.4 K/min 時固體ee 值隨結晶時間變化情況如圖11所示。在同一晶種加入量下，固體ee值下降趨勢隨降溫速率的加快而增加，這是因為降溫速率越快，成核推動力越大，成核速度快，產品光學純度降低越快；在同一降溫速率下，固體ee 值變化趨勢隨晶種加入量的增加而變緩，這是因為純D-對映體晶種加入量越多，越高比例的過飽和度消耗于生長而不是成核，由于D-晶種具有一定的光學選擇性，晶種越多，ee值降低越慢。

2.6.2 結晶收率 按照2.6.1 節的實驗結果重復實驗并分析固體ee值始低于99%時間點時產品收率，結果如表2 所示。在相同的起始料液和降溫速率下，晶種加入量增加，收率增加，這與2.6.1節中結晶產品始低于99%的時間點越長是一致的。在相同的起始料液和晶種加入量下，降溫速率減小，收率增加，這是由于：一方面，雖然到達固體ee 值始低于99%的時間點較長，但降低的溫度較小，這會導致產品收率下降；但另一方面，降溫速率的降低，產品粒度增大，過濾后產品也會增多。

3 結 論

（1）通過靜態法測量溶解度數據，繪制不同溫度下青霉胺溶解度曲線。同時測量了D-青霉胺、DL-青霉胺以及ee值為87%溶液的介穩區寬度。

圖11 固體ee值在不同降溫速率中隨時間變化曲線Fig.11 Curve of solid ee values over time at different cooling rates

表2 青霉胺降溫結晶收率Table 2 Yield of penicillamine of cooling crystallization

（2）通過成核實驗發現，對于ee 值大于二元共飽和點的起始溶液，其初始晶核的ee 值總是高于起始溶液的ee 值，但隨著成核溫度的降低，初始過冷度的增加，晶核量越多，ee值越小。

（3）考察了降溫速率、晶種量對降溫結晶過程中產品ee 值和收率隨時間的變化情況，對于相同的起始溶液，ee 值大于99%的產品收率隨著晶種的加入量和降溫速率的減小而增加。

（4）研究表明，對于青霉胺這一手性體系，優先結晶法可在一定程度上提高固體的光學純度，但收率較低，需要開發更為高效的手性結晶拆分技術與工藝。

符 號 說 明

M——摩爾質量，g/mol

m——質量，g

T——熱力學溫度，K

ΔT——過冷度，K

t——時間，min

x——摩爾分數溶解度