多囊泡型二氫楊梅素脂質體的制備、表征及其抑菌性能

羅帆，曾丹丹，楊遠廷，，胡洪超，田允波，王文雄，舒緒剛，，楊富杰

（1 仲愷農業工程學院化學化工學院，廣東廣州510225； 2 香港城市大學能源與環境學院海洋污染國家重點實驗室，香港999077； 3 廣東省水禽健康育種重點實驗室，廣東廣州510225）

引 言

截止至今，細菌類傳染病已對全球公共衛生安全造成嚴重負擔[1]。隨著細菌耐藥性的增強，越來越多的抗生素功效顯著下降[2-3]。超級細菌的爆發已導致大批量人口死亡和輿論恐慌，特別是對于衛生條件差的發展中國家[4-5]。根據世界衛生組織統計，耐藥性細菌每年可能導致全世界約70 萬人死亡。一些學者預測，如果不努力減少細菌耐藥性或開發新抗生素，到2050 年，這一數字將達到1000 萬人[6]。 金 色 葡 萄 球 菌（Staphylococcus aureus, S.aureus）是一種最為常見的人類病原菌，廣泛存在于人體各種組織，從表面如皮膚到深層組織如胃腸道、心臟和骨骼等[7]。S.aureus 在健康的皮膚上不會引起感染，但在深層組織內部或血液卻會引起各種威脅人體生命安全的疾病，如心內膜炎、慢性骨髓炎、肺炎或菌血癥等[8]。令人驚訝的是，S. aureus 可以在入侵和共生這兩種狀態之間切換，這就導致其無法完全被免疫系統識別，難以根除[7]。最新流行病學發現，在20%～40%的調查人口的鼻黏膜共生菌群中均存在S.aureus[9]。因此，迫切需要尋找一種新的治療策略來應對日益嚴峻的S.aureus挑戰。

藤茶是一種傳統的中草藥植物，廣泛生長在中國南方。根據《中草藥》記載，藤茶具有清熱利濕、平肝降壓、活血通絡等多種功效[10]。現代臨床實驗也證實，藤茶富含一種學名為二氫楊梅素（dihydromyricetin,DMY）的多酚類黃酮物質，其嫩莖和嫩葉中含量高達30%以上[11]。DMY 的許多生物活性已經被證實，如抗癌、抗炎癥，抗酒精中毒，肝保護和心臟保護作用等[12-14]。而最新的生物學實驗表明，DMY 對S.aureus 具有較強的抑菌活性。DMY能與S.aureus細胞膜上的膜脂肪和蛋白發生相互作用，導致其構象發生變化，破壞細胞膜的流動性，導致細菌死亡[15]。然而，DMY 存在水溶性低、生物半衰期短、膜滲透力差等缺點，難以進行臨床藥物開發[16]。Liu 等[17]的研究表明DMY 在大鼠體內的口服生物利用度僅為4.02%。因此，尋求一種藥物傳遞載體以提高DMY的生物利用率是必要的。

脂質體是一種典型的藥物載體，具有低毒、高生物相容性、低免疫原性等優點，可搭載容納各種親水親油藥物或一些小顆粒納米粒子[18]。現代藥物開發常在脂質體的基礎上對其進行結構修飾和表面修飾，以制備出具有特異生物學效應的新型脂質體，極大地拓展了脂質體在生物醫學中的應用[19]。在所有可用修飾壁材中，聚乙二醇（PEG）聚合物是穩定脂質體最為成功的材料之一[20]。PEG能夠屏蔽免疫系統的感知，避免脂質體被吞噬細胞吞噬，提高藥物的生物利用率[21]。有趣的是，一些細菌生物實驗表明，脂質體的應用能進一步提高耐甲氧西林的穩定性，并延長藥物對S.aureus 的抑菌時間[22]。

本研究以藤茶為原料，采用水熱提取法提取DMY。以蛋黃卵磷脂為脂質體模板，聚乙二醇4000（PEG 4000）為修飾壁材制備多囊泡型二氫楊梅素脂質體（DMY-lips），以期解決DMY 水解度低、生物半衰期短、膜滲透力差等問題。采用各種表征方法對制備的DMY-lips 進行系統的結構表征和形態觀察，并進一步研究其對S.aureus的抑菌活性、抑菌效率和抑菌機理。

1 實驗材料和方法

1.1 試劑與儀器

藤茶采集自中國廣西壯族自治區梧州市；PEG 4000（分析純），天津市大茂化學試劑廠；吐溫80（細胞培養級），阿拉丁試劑（上海）有限公司；膽固醇（＞99%），上海麥克林生化科技有限公司；蛋黃卵磷脂（生物醫藥級），艾偉拓（上海）醫藥科技有限公司；LB 營養瓊脂和LB 肉湯，北京索萊寶科技有限公司；金色葡萄球菌（S. aureus）取自本單位生化實驗室。

S22PC 型紫外分光光度計，上海棱光技術有限公司；Alpha 1-2 LD Plus 型真空冷凍干燥機，德國Christ公司；Spectrum100型傅里葉紅外光譜儀，美國PerkinElmer 公司；90 Plus PALS 型納米粒度測試儀，美國布魯克海文儀器公司；Tecnai G2 F20 型透視電子顯微鏡，美國FEI 公司；D8 Advance 型X 射線粉末衍射儀，德國Bruker 公司；TGA2 型同步熱分析儀，美國梅特勒-托利多儀器公司；CT-3030 電導率儀，深圳市柯迪達電子有限公司。

1.2 DMY的提取與純度檢測

將采集好的藤茶莖葉烘干、粉碎，過篩，封裝備用。準確稱取20 g藤茶粉末并溶于400 ml去離子水中，使用2 mol/L NaOH 溶液調節溶液pH=5，并置于100℃水浴提取0.5 h。趁熱過濾，棄濾渣，將提取液旋蒸濃縮至80 ml，放置4℃冰箱冷藏保存。24 h 后過濾，棄濾液。將DMY 粗提取物溶于15 ml 無水乙醇中，過濾，棄濾渣，再將溶液置于60℃鼓風烘干保存6 h 以除去溶劑。將固體樣品溶于80℃熱水中，趁熱過濾，棄濾渣，待溶液自然冷卻析出結晶后，即得到純DMY樣品。

精確稱取0.01 g DMY 樣品并溶于100 ml 95%的乙醇中，以獲得濃度為0.1 mg/ ml 的DMY 溶液。使用紫外分光光度計，在λ＝293 nm 處測量DMY 的吸光度。DMY 的標準濃度（C）與吸光度（A）線性方程為A=48.3085C-0.00829，R2=0.9988。

1.3 DMY-lips的制備

準確吸取60 μl吐溫80 和0.02 g PEG 4000 并溶于40 ml 磷酸緩沖溶液（pH=6.5）中，得到水相溶液。另取0.04 g DMY、0.05 g 膽固醇和0.30 g蛋黃卵磷脂并溶于16 ml 無水乙醇中，充分攪拌后得到油相溶液。在磁力攪拌機（300 r/min）的轉動下，使用5 ml注射器吸取油相（含DMY 相液）溶液并逐滴加入水相中。滴定完成后，將混合溶液置于47℃水浴鍋輕微攪拌（100 r/min）3～4 h 以除去乳濁液中無水乙醇。待溶液保持恒定體積后，即得到DMY-lips溶液。

1.4 DMY-lips載藥率檢測

吸取5 ml DMY-lips 溶液于離心管中，6000 r/min 下離心20 min。吸取1 ml 上清液于25 ml 容量瓶中并定容，于λ＝293 nm 處測量未包覆的DMY 的吸光度。根據式（1）計算出載藥率

式中，mtotal為體系中DMY 總質量，mg；mfree為體系中未包覆的DMY質量，mg；EE為載藥率，%。

1.5 結構表征

采用納米粒度測試儀（DLS）測定DMY-lips 的粒徑與Zeta 電位；采用透視電子顯微鏡觀察DMYlips 的微觀形態與粒徑分布；使用紫外分光光度計（UV-vis）記錄DMY、空白脂質體（Blank-lips）和DMY-lips在260～450 nm范圍內的波長。

采用真空冷凍干燥機凍干Blank-lips 和DMYlips 溶液，得到相應的固體樣品。使用傅里葉紅外光譜儀（FTIR）在4000～450 cm-1范圍內對DMY、Blank-lips 和DMY-lips 進行紅外分析；使用X 射線粉末衍射儀（XRD）在10°～80°范圍內測定DMY 和DMY-lips 的結晶相；在N2的保護下，通過同步熱分析儀（TGA）考察DMY、Blank-lips 和DMY-lips 在40～900℃下的熱穩定性。

1.6 抗菌測試

1.6.1 抑菌活性測定 將0.04 g DMY 加于40 ml 磷酸緩沖溶液（pH=6.5）中，60℃溶解，冷卻，得到1.00 mg/ml的DMY溶液。DMY溶液現配現用。

采用瓊脂擴散法，以DMY、Blank-lips 溶液為對照，研究DMY-lips 對S.aureus 的抑菌性能[23]。配制25 ml 瓊 脂 培 養 基，高 壓 滅 菌20 min（0.1 MPa，121.5℃）。在無菌超凈臺中，將滅菌完的培養基倒入無菌玻璃培養皿中，冷卻凝固。吸入100 μl S.aureus 菌液于培養基中，涂布均勻。借助打孔器在培養基中鉆出三個直徑為4 mm 的圓孔，各加入80 μl 藥品，封裝培養皿，然后將培養皿置于37℃培養箱培養24 h，多次實驗后用交叉法測得抑菌圈的直徑。

1.6.2 細菌生長曲線測定 將0.04 g DMY 加于40 ml 磷酸緩沖溶液（pH=6.5）中，60℃溶解，冷卻，得到1.00 mg/ml的DMY溶液。DMY溶液現配現用。

以無菌磷酸緩沖溶液（pH=6.5）為空白對照組，測試DMY 和DMY-lips 溶液對S.aureus 的生長性能的影響。在無菌超凈臺中，吸取20 μl S.aureus菌液（106CFU/ml）于無菌96孔板孔中，加入80 μl滅菌冷卻完的LB 肉湯液體培養基，輕微搖晃均勻，然后加入100 μl 藥品溶液。將96 孔板封裝后放置37℃恒溫搖床培養24 h，培養期間每隔一段時間使用酶標儀測定菌液的OD600值。每個處理平行3次實驗。

1.6.3 最小抑菌濃度（MIC）測定 以磷酸緩沖溶液（pH=6.5）為稀釋液，采用二倍稀釋法稀釋得到不同濃度的DMY-lips 溶液。在無菌超凈臺中，向6 個96孔板孔中分別加入20 μl S.aureus菌液（106CFU/ml）和80 μl 滅菌冷卻完的LB 肉湯液體培養基，輕微搖晃均勻后，分別向不同板孔中加入100 μl 不同濃度的DMY-lips 溶液以促使混合菌液中DMY 的最終濃度分別為0、0.05、0.10、0.20、0.30 和0.50 mg/ml。將96 孔板封裝后放置37℃恒溫搖床培養24 h，培養期間每隔一段時間使用酶標儀測定菌液的OD600值，以細菌被抑制的最低抑菌劑濃度作為MIC[24]。每個處理平行3次實驗。

1.6.4 生物掃描電鏡觀察 在無菌條件下，吸取200 μl S. aureus 菌液（106CFU/ml）和800 μl 滅菌好的LB肉湯液體培養基于干凈的2 ml離心管中，再加入1000 μl 2倍MIC（2 MIC）的DMY-lips溶液。封裝離心管，37℃恒溫搖床培養6 h，3000 r/min 離心10 min，倒去溶液，再加入2 ml 2.5%的戊二醛溶液，4℃冷藏12 h 以固定沉淀在管底的細菌。倒去固定液，使用磷酸緩沖液（pH=7.0）漂洗樣品三次。用1%的鋨酸溶液固定樣品1～2 h，再用磷酸緩沖液（pH=7.0）漂洗樣品三次，使用乙醇溶液梯度洗脫細菌樣品，干燥，噴金，采用生物掃描電鏡觀察S.aureus 菌體的形態變化。

1.6.5 電導率測定 根據處理前后菌液電導率變化判定細菌內容物的滲漏情況[25]。準確吸取4 ml S.aureus 菌液（106CFU/ml）于15 ml 離心管中，3000 r/min 離心10 min 以收集菌體，使用滅菌后的磷酸緩沖溶液（pH=7.2～7.4）清洗三次，并重懸至體積為15 ml。吸取2 ml 菌液于新的5 ml 離心管中，加入2 ml 2 MIC 的DMY-lips 或等量磷酸緩沖溶液（對照組），37℃恒溫搖床培養0、3 和6 h。取出離心管，5000 r/min 離心10 min。吸取1 ml 上清液并用超純水定容至25 ml，用CT-3030 電導率儀測量其電導率。每個處理平行3次實驗。

1.7 穩定性測試

將DMY-lips 儲存于不同溫度（4、25 和37℃）的磷酸緩沖溶液（pH=6.5）中以進行為期一個月的穩定性考察[26]。在整個實驗階段，每隔一段時間采用紫外分光光度計和納米粒度測試儀測定DMY-lips的載藥率、粒徑和zeta電位。

2 結果與討論

2.1 TEM與粒徑分析

本研究所得DMY-lips 的宏觀形態與微觀結構如圖1 所示。由圖1(a)ⅰ看出，新鮮的DMY-lips 溶液為透明淡黃色。通過激光筆照射，DMY-lips 溶液出現明顯丁達爾效應[圖1(a)ⅱ]，表明樣品為膠體溶液[27]。利用納米粒度測試儀測定DMY-lips 溶液的粒徑分布如圖1(b)，可見DMY-lips 粒徑均一，平均粒徑約為155 nm（PDI= 0.077），zeta 電位為(13.23±1.02)mV。由于DMY-lips外殼受PEG 4000包覆，其能降低粒子間的靜電吸引，避免粒子發生團聚，提高粒子的分散性[28]。采用TEM 觀察DMY-lips 微觀結構如圖1(c)、(d)，發現DMY-lips 為球狀結構，粒徑低于200 nm，分散均勻，與粒徑測試結果一致。圖1(d)中，DMY-lips 被發現具有雙層結構，脂質體內含多個囊泡，這將有利于藥物的負載與跨膜運輸[20,29]。Caddeo等[30]研究發現PEG不僅有利于磷脂分子排列成小且均一的結構，還能促進親脂類黃酮的溶解，從而使其在囊泡內被負載。值得注意的是，UV-vis分析表明，DMY-lips 的載藥率為42.93%，優于一般工藝制備的脂質體的載藥率（低于10%）[31]。

2.2 UV-vis和FTIR分析

為確定DMY 的成功包覆，對DMY、Blank-lips和DMY-lips 進行UV-vis 和FTIR 分析，如圖2 所示。由圖2(a)發現，Bank-lips 在260～450 nm 范圍內無明顯吸收峰。與此相反，DMY 在292.35 nm 處存在明顯吸收峰，為其肉桂酰系統能級躍遷的結果[32]。在進行包覆處理后，由于DMY 的共軛體系發生改變，肉桂酰系統的吸收峰遷移至323.95 nm[33]。在圖2(b)中，DMY 曲線在3291 cm-1處的吸收峰是由—OH 的伸縮振動引起的，而1641 cm-1和1329 cm-1分別為C O 和C—OH 的伸縮振動峰[34]。對于Blank-lips曲線，2923 cm-1和2853 cm-1處的吸收峰為脂質體外殼PEG4000 上C—H 的伸縮振動，而1737 cm-1和1104 cm-1處吸收峰分別對應C O 和C—O—C 的拉伸振動[21,35]。值得注意的是，DMY-lips 的FTIR 譜圖與Blank-lips 整體骨架相似，且不存在DMY 的結構特征峰，表明脂質體的包覆方式為物理包覆[36]。而DMY-lips曲線在3423 cm-1處新出現吸收峰，可能與DMY 上的—OH 的伸縮振動有關。因此，結合UVvis 和FTIR 的分析結果可初步證實DMY 的成功包覆。

圖1 DMY-lips的宏觀形態與微觀結構Fig.1 Morphology and microstructure of DMY-lips

2.3 XRD分析

為進一步研究DMY-lips 的結晶結構特征，對DMY 和DMY-lips 進行XRD 分析，如圖3 所示。由圖3（a）發現DMY具有一系尖銳且強烈的布拉格峰，與Wang 等[37]報道的XRD 譜圖一致，說明DMY 為晶體化合物。相比之下，DMY-lips 的XRD 譜圖發生明顯變化[圖3(b)]，并且未發現任何DMY 特征衍射峰，這可能是由于DMY被包覆到脂質體內部所致。

2.4 TG和DTA分析

在納米藥物的包裝和儲存中，脂質體的熱穩定性對其藥物開發與研究應用關系重大。因此，使用同步熱分析儀考察DMY、Blank-lips 和DMY-lips 在40～900℃下的熱穩定性，如圖4 所示。由圖4（a）可以看出，DMY 的熱分解分為四個階段，150℃以下的質量損失為游離水和結晶水的蒸發所致，失重率為12.88%；在150～310℃范圍內DMY 的失重率為12.62%，對應的DTA 分解溫度為260.34℃，與Zhang等[38]報道的DMY 的熔點相近；繼續升高溫度至380℃，對應的DTA 分解溫度為365.78℃，該階段的質量損失（12.08%）可能是由吡喃環與殘余苯環之間的C—C 化學鍵的斷裂導致的[39]。此后，DMY 的失重率隨溫度的升高而增大，900℃下DMY 的總失重率為64.97%。相比之下，Blank-lips[圖4(b)]在150～900℃范圍內只存在一個熱分解階段，對應的DTA 分解溫度為398.27℃，總失重率為100%。值得注意的是，完成包覆處理后DMY-lips的熱分解溫度降至369.99℃[圖4(c)]，這可能是由于DMY 的插入擾動脂分子的堆積，導致其協同度降低，進而促使脂質體的熱穩定降低[40]。此外，相比Blank-lips的總失重率為100%，DMY-lips 在40～900℃范圍內的總失重率只有86.97%，也為DMY 的成功包覆提供了證據。

圖2 DMY-lips的譜圖分析Fig.2 Spectrum analysis of DMY-lips(i)DMY;(ii)Blank-lips;(iii)DMY-lips

圖3 DMY（a）和DMY-lips（b）的XRD譜圖分析Fig.3 XRD patterns of DMY(a)and DMY-lips(b)

圖4 熱穩定性分析Fig.4 Thermal stability analysis

2.5 抑菌活性分析

圖5 抑菌分析Fig.5 Bacteriostatic analysis

DMY、Blank-lips 和DMY-lips 對S. aureus 的抑菌效果如圖5 所示。從圖5(a)～(c)中可以看出，Blank-lips 無抑菌效果，其培養皿三個藥孔周圍均存在S. aureus 菌落。而DMY 對S. aureus 抑菌效果也不明顯，抑菌圈為（8.04 ± 0.57）mm。相比之下，DMY-lips 對S. aureus 的抑菌效果顯著，抑菌圈為（14.38±0.13）mm，說明脂質體的包覆使DMY 對S.aureus 的抑菌活性提升了78.86%。為進一步對比DMY 和DMY-lips 的抑菌活性，使用酶標儀測定DMY 和DMY-lips 處理后S.aureus 生長曲線，如圖5（d）所示。在無藥物處理（對照組）的情況下，S.aureus 遵循對數生長原則，培養24 h 后細菌生長趨于平穩。當與DMY 共培養后，S.aureus 細菌的生長受到抑制，但在18 h 后又恢復正常生長。這主要是由于S.aureus 存在耐受性，即通過自身交叉保護反應來抵抗外界不利的生長環境，如酸、冷、抗生素藥物等[41]。值得注意的是，圖5（d）中發現相比DMY，DMY-lips 不僅表現出更好的抑菌活性，而且具有較長的抑菌作用時間。經DMY-lips 處理的S.aureus，其生長狀態受到明顯的抑制。培養24 h 后，DMYlips 組菌液的OD600值（0.63）顯著低于對照組（1.11）和DMY 組（1.02）。一些學者推測，脂質體不僅可以提高親脂性藥物的水溶解度，而且還能幫助藥物穿透細胞膜并擴散到細菌內部[42]。此外，脂質體的包覆還能減緩藥物釋放，持續長久殺菌，避免細菌細胞產生耐受性[43]。

2.6 MIC分析

MIC 被解釋為能抑制細菌生長的最低藥品濃度[24]。圖6顯示不同濃度的DMY-lips處理后的金色葡萄球菌的生長曲線。OD600值高表示細菌濃度高，抗菌性能差[24]。對于空白對照組（0 mg/ml），S.aureus活菌數隨時間延長而增加，呈對數曲線生長，24 h 的OD600值為1.12。在與DMY-lips 共培養后，S.aureus 的生長受到抑制，活菌數生長速率與數量不及對照組。DMY-lips 的濃度越高，S.aureus 的OD600越低，抑菌效果更明顯。S.aureus 經DMY-lips 濃度為0.05 mg/ml 和0.10 mg/ml 處理24 h 后的OD600分別為0.92 和0.95，表明DMY-lips 對S.aureus 的MIC 為0.05 mg/ml。

圖6 不同濃度的DMY-lips處理的金色葡萄球菌的生長曲線Fig.6 Growth curves of S.aureus treated with different concentration of DMY-lips

2.7 生物掃描電鏡與電導率分析

采用生物掃描電鏡觀察DMY-lips 處理前后S.aureus 菌體的微觀形態變化，如圖7(a)、(b)所示。未處理的細菌細胞表面平坦光滑，形態完整，球狀結構清晰；相比之下，DMY-lips 處理后的菌體形態扭曲畸形，表面凹凸不平，細胞發生粘連，說明DMYlips能破壞S.aureus菌體的細胞壁，導致細菌胞內原生質溶出而死亡。為進一步揭示DMY-lips 的抑菌機理，利用電導率儀測量處理前后菌液電導率變化判定細菌的滲漏情況，如圖7（c）所示。與對照組相比，經過DMY-lips 處理的S.aureus 菌液的電導率顯著提升，且隨著時間的延長而增大。相比對照組（269.00 μS/cm），經DMY-lips 處理6 h 后的S.aureus菌液的電導率提升至309.00 μS/cm，說明DMY-lips可以破壞菌體的細胞壁和細胞膜，導致胞內鉀、鈉離子的泄漏，與生物掃描電鏡觀察結果一致[15]。

2.8 穩定性分析

在三種不同的儲藏溫度下對DMY-lips 進行了為期30 d的穩定性評價，如圖8所示。由圖8(a)可以看出，4℃冷藏的DMY-lips 溶液依然為淡黃色透明，而25℃和37℃保存的DMY-lips 溶液均變化成白色渾濁乳液，這表明25℃和37℃保存的DMY-lips溶液可能變得不穩定。為進一步研究脂質體的載藥性能，采用納米粒度儀和紫外分光光度計測定三種DMY-lips 的載藥率、顆粒大小、zeta 電位，如圖8(b)～(d)所示。與4℃保存的DMY-lips 溶液的載藥率、顆粒大小、zeta 電位保持相對穩定不同，25℃和37℃保存的DMY-lips 溶液發生明顯變化。25℃保存的DMY-lips 溶液的載藥率從39.82%下降至14.15%、顆粒大小從108.42 nm 增大至178.96 nm、zeta 電位從-12.46 mV 變化至-5.60 mV，而37℃保存的DMYlips 溶液的載藥率從39.59%下降至10.05%、顆粒大小 從108.26 nm 增 大 至204.04 nm、zeta 電 位 從-12.49 mV 變化至-2.17 mV。這可能是因為高溫加速了脂質體的水解和氧化，與Liu等[36]報道的結果一致。因此，該實驗結果表明低溫更有利于DMY-lips的完整性保存。

圖7 抑菌機理分析Fig.7 Antibacterial mechanism analysis

3 結 論

多囊泡型脂質體作為藥物載體可有效提高DMY的水溶解度和膜滲透度，充分發揮其對S.aureus抑菌性能。通過生物掃描電鏡和電導率測試發現，DMYlips可以破壞S.aureus的細胞壁和細胞膜，導致菌體胞內原生質泄漏而死亡。利用PEG 4000進行結構修飾以促使磷脂形成粒徑均一、分散均勻的脂質體，有利于增強載藥脂質體的穩定性和壽命。聚乙醇化脂質體的包覆能夠緩解藥物的過快釋放，延長DMY的抑菌作用時間，避免S.aureus產生耐受性（耐藥性）。與其他化學抗生素相比，DMY-lips具有生物與環境友好、有序可控等優勢，在未來納米結構設計和抗菌藥物開發中具有巨大潛力。

圖8 不同溫度儲藏一個月后DMY-lips的穩定性Fig.8 Stability of DMY-lips stored at different temperatures for one month