光遺傳學在治療神經內科疾病中的研究進展

王運茜，薛清萍，馮曦兮，邢國剛，徐 帆*

（1. 成都醫學院公共衛生學院，成都 610500；2. 北京大學醫學部基礎醫學院，北京 100091）

自2002 年國外有實驗室首次用光受體蛋白來調控神經活動取得成功以來，光遺傳學技術便迅速地走進人們的視野。光遺傳學是光學和分子遺傳學交叉融合的產物，在醫學領域廣泛應用于研究各類疾病的發病機制與治療方法，其中研究最多的是神經功能方面的疾病。近年來，隨著該技術的發展，一系列有關光遺傳學的科學研究與相關技術應用層出不窮。光遺傳學技術儼然成為研究神經科學的重要手段。

1 光遺傳學的發展簡史

光遺傳學最早起源于神經科學，是一種利用載體將光敏感蛋白植入可興奮的動物神經元中，然后光照受體蛋白，從而達到控制神經元、影響生物體生理活動的研究方法。

該研究方法萌芽于1979 年。美國著名科學家克里克（Francis Crick）在Thinking about the brain中提出，在不損傷其他神經元的情況下，開發出一種新的技術，精確控制特定的大腦神經元，以進一步開展大腦神經科學領域的研究［1］。2002 年，奧地利神經科學家米森伯克（Gero Miesenb?ck）和其實驗室成員將果蠅的視紫紅質基因植入海馬神經元標本中，再使用光照激活受體蛋白，最后成功控制了神經元的活性［2］。這是歷史上體外光控神經元取得的首次成功。米森伯克由此被視為光遺傳學領域的開拓者之一。隨后，《自然神經科學》雜志在2005 年9 月刊登了一篇光遺傳學領域的開山之作——《毫秒時標，神經活動的基因靶向光學控制》。在這篇文章中，研究人員利用光照調控視蛋白，精確控制了生物體的大腦神經元，并且還證實了植入的光敏感蛋白——通道蛋白視紫紅質2（channelrhodopsin-2，ChR2）對細胞功能無任何損害作用［3］。緊接著，Diesseroth 等［4］為描述此種，將光學與遺傳學操作相結合，從而實現對特定神經元活性精準控制的研究手段，并在2006 年首次提出了光遺傳學這個詞語。

光遺傳學技術是在光遺傳學研究上發展出來的新興技術。該技術通過向靶細胞內導入光敏蛋白基因，再利用光纖導入或向大腦內植入發光二極管的方式照射光敏感蛋白，從而實現對神經元的激活或抑制，最后可觀察神經電生理的改變［5］。

2 光敏感蛋白的發現

2.1 細菌視紫紅質（BR）

實現光遺傳學技術的其中一個關鍵步驟為光敏感蛋白的發現和使用。細菌視紫紅質（bacteriorhodopsin，BR）首先被描述為一種單組分跨膜（transmembrane，TM）蛋白，能夠將質子從細胞內空間轉移到細胞外空間［6］。早在1971 年，Oesterhelt等［7］借鑒青蛙視紫紅質的研究方法，首次在古細菌鹽藻細胞膜中發現了視紫紅質，因此其又被稱為古細菌視紫紅質。由于在細菌和動物體內都發現了視紫紅質，所以其被重新定義為一種動物和微生物體內含有視網膜生色團的光活性蛋白質。1973 年，Oesterhelt 等［8］發現光照BR 能夠引起氫離子外流，從而證實了其為一種光驅向外質子泵。因其通過光照可改變細胞膜內外電位差，所以BR 可作為光遺傳學控制靶細胞的一種工具。

2.2 嗜鹽菌視紫紅質（HR）

1977 年，Matsuno-Yagi 等［9］又在古細菌中發現了嗜鹽菌視紫紅質（halorhodopsin，HR），也稱氯視紫紅質或鹽細菌視紫紅質。Schobert 等［10］在1982 年發布的研究表明，HR 是一種由光驅動的氯離子泵，此發現與之前提出的HR 是一種向外驅動鈉離子泵截然不同。HR 與BR 作用原理相同，均為超極化反應，但其吸收560～580 nm 的黃光。光遺傳學技術發展至今，科學家們在鹽藻和細菌中發現BR 和HR后，相繼在真菌和其他微生物中也發現了多種視紫紅質［6］。這些視紫紅質統稱為微生物視紫紅質。

2.3 通道蛋白視紫紅質（ChRs）

2002 年，Nagel 等［11］又在萊茵衣藻中發現了第三類電導調節的微生物視紫紅質——通道蛋白視紫紅質（channelrhodopsins，ChRs）。它是一種光門控陽離子通道，可通過不同波長光的刺激來控制陽離子進入細胞，改變膜內外電位差，從而達到膜去極化的作用［12］。2002 年在萊茵衣藻中發現的通道視紫紅質1（channelrhodopsin-1，ChR1）是第一個被鑒定的ChRs，其主要介導氫離子的傳遞［11］。但由于其導電性低，故并不適合作為光敏蛋白。次年，通道視紫紅質2（channelrhodopsin-2，ChR2）的生物功能也逐步被探索出來［13］。經過證明，ChR2 只需要簡單的光照就可以讓細胞產生去極化作用。近幾年來，研究人員不斷探索微生物視紫紅質，在ChR1 或ChR2 的結構基礎上不斷改進。2013 年，Govorunova等［14］發現了最大吸收波長在445 nm 處的PsChR。該視蛋白比ChR2 對鈉離子選擇性更強，對光更加敏感。ChRGR（ChR-green receiver）是在ChR1 的結構基礎上進行改進得到的嵌合體蛋白分子，具有最小的脫敏特性和靈敏的動力學特征［15］，有望被應用在光遺傳學研究中。

除以上兩種改良蛋白外，目前還發現了C1V1（ChR1/VChR1 Chimera）、ReaChR、CnChR1（Chrimson）、ChRFR（ChR-fast receivers）、ChIEF、ShChR（hronos）等ChRs 類視蛋白［16-20］，這些通道蛋白的出現使光遺傳學技術在科學探究上更進了一步。ChRs 現已成為應用最多、研究最廣的微生物視紫紅質。

圖1 微生物視紫紅質的功能Fig. 1 Function of bacteriorhodopsin

3 光遺傳學的臨床研究發展現狀

3.1 腦卒中

腦卒中是一種急性腦血管疾病，也是嚴重危害人類健康的神經性疾病之一［21］。其發病機制是腦部血管突然破裂，或者因血管阻塞導致血液不能流入大腦，從而引起腦組織損傷。目前臨床上治療腦卒中的方法有藥物治療、血管內治療、腦細胞移植、腦刺激法和經顱光生物刺激療法等［22］。其中腦刺激法直接靶向調控致病區神經元，可細分為經顱直流電刺激、經顱磁刺激、硬膜外刺激三種。傳統腦刺激法能激活或者抑制致病區的所有神經元，因而我們無法準確定位具體調控腦卒中發生與恢復的細胞。且使用該方法對患者身體會產生一定的副作用。治療時，腦刺激法敵我不分，一些正常的神經元也會被攻擊，從而受到損傷，導致術后出現頭暈、精神亢奮等癥狀。經顱光生物刺激療法的原理是使用低功率激光直接照射頭部，或者開顱后將激光運輸到受傷腦組織，通過光照活化細胞色素c 氧化酶（cytochrome c oxidase，CCO）后，CCO 發生一系列二次事件來調控細胞。它的作用原理與光遺傳學研究方法相似，但在精確調控細胞方面又顯示出不足，且目前尚不清楚用多大功率的光能透過某處大腦實質產生生物效應。已有的研究顯示，光遺傳學技術能夠通過刺激缺血周圍區域神經元，如光生抑制紋狀體γ-氨基丁酸能神經元（GABAergic neurons），以改善組織狀況［23］、精確調控靶細胞，并彌補光刺激法的不足。而在腦缺血小鼠模型中，通過使用光遺傳技術調控運動區的不同回路已經實現了運動功能的恢復［24］。目前，科學家們已探索出大腦中與腦卒中致病機制及恢復相關的一些靶向區域，如同側運動皮質、不同的皮質脊髓回路和神經源性小生境腦室下區等，為將光遺傳學進一步應用于腦卒中的臨床治療提供了可能的研究方向。

3.2 帕金森病（PD）

帕金森病（Parkinson’s disease，PD）是世界上第二大神經系統退行性疾病，多發生于老年人。該病主要表現特征為動作緩慢、肌肉僵硬，以及肢體或者身體其他部位靜止性震顫，同時還伴隨有認知功能障礙和自主神經功能紊亂等問題［25］。PD 的主要致病機制是大腦黑質密部多巴胺神經元丟失，但目前并不清楚引起多巴胺神經元丟失的原因［26］。現階段PD 患者主要依靠藥物治療，但始終達不到徹底根治的效果，還會產生藥物耐受等副作用。因此，我們需要尋求一種新的治療方法，能夠突破傳統治療方法的局限，針對病癥治標治本。光遺傳學技術的出現為治療PD 帶來了曙光。Kravitz 等［27］發現光刺激紋狀體直接通路中間投射神經元能明顯改善小鼠的僵硬、運動緩慢的行為，說明基底神經節回路能調節PD 的運動癥狀，直接通路中間投射神經元與PD 運動癥狀的發生有關。這個發現表明，紋狀體可作為臨床上治療PD 運動癥狀的靶點。

2010年，Bass等［28］在試驗中利用光遺傳學技術控制多巴胺神經元的離子通道，以此來精確控制多巴胺的釋放。通過此種方法治療PD，不僅避免了藥物帶來的運動障礙等副作用，而且不會損傷其他不相關的神經元。PD 功能認知障礙是一種非運動癥狀。早前有臨床數據表明，藍斑去甲腎上腺素能神經元（locus coeruleus norepinephrine neuron，LC-NE）與之密切相關［29-30］。2012 年，Vazey 等［31］將光敏感蛋白植入LC-NE 中，并利用光刺激整合了光敏感蛋白的LC-NE ，結果表明其能夠調節對外觀環境的感知。因此，光遺傳學技術被認為在治療PD的運動癥狀與非運動癥狀方面上均有較好的應用前景。

3.3 癲癇

癲癇是大腦神經元突發性同步異常放電導致短暫的大腦神經功能障礙的一種慢性腦部疾病［32］。其發病主要原因是神經元回路的興奮與抑制失調。發作時，異常興奮的神經元處于動態中，因此有針對性的精確控制神經元活動的時間顯得較為困難［33］。現階段癲癇的主要治療方法有藥物治療、手術和電刺激療法。臨床上常用的治療方式為藥物治療。這種治療方法能控制大部分癲癇患者的發病，但由于藥物是多靶點治療，在治療致病細胞的同時也會損傷其他神經元［34］。此外，還有少部分患者發展成為耐藥性癲癇，藥物對其作用效果不明顯。光遺傳學作為能精準控制細胞的嶄新技術，為治療癲癇開辟了一條新通道。

目前，利用光遺傳學技術治療癲癇的原理主要是調節抑制性中間神經元活性和興奮性錐體細胞［35］。NpHR（natromonas pharaonis halorhodopsin）是一種氯離子泵，屬于HR 類光敏感蛋白，能引起細胞產生超極化反應。2009 年，Tonnesen 等［36］在體外建立海馬區癲癇模型，并且將NpHR 植入海馬錐體細胞和顆粒細胞內，利用黃光照射，最后證明了光控NpHR 能縮短癲癇發作的時間。該試驗為光遺傳學技術治療癲癇提供了依據。Sukhotinsky 等［37］在2013 年又通過體內癲癇模型——活大鼠海馬區椎體神經元植入eNpHR3.0，證實了光照能延緩癲癇持續狀態的潛伏期。試驗結果顯示，光遺傳學治療在一定程度上可減輕癲癇癥狀。同年，Selvaraj 等［38］報道，使用開環光生控制能抑制癲癇樣活動發作。他們使用ChR2 研究了脈沖和恒定光照對離子通道電導的影響，結果顯示，光生通道的固有特性確保了大腦皮層的電荷平衡，抑制細胞群是開環控制的目標，從而使癲癇發作波被成功地抑制。從目前多個研究結果來看，光遺傳學治療癲癇的可行性在于其能精確控制靶細胞活性以及在時間上的高效把控，且使用光刺激調控細胞的反應能在毫秒內發生，無需等待其他介質的傳遞。

4 總結與展望

通過本篇綜述，我們著重討論了光遺傳學技術治療腦卒、PD 和癲癇的研究進展。從以上所述的研究現狀來看，光遺傳學在神經內科疾病中的應用目前正處于探索階段，僅限于實驗室的研究，暫時還不能直接應用到疾病的診斷和治療中。不可否認的是，光遺傳技術目前也存在許多尚未解決的問題。如有限的細胞特異啟動子直接決定了病毒載體運送的光敏基因調控的細胞種類，因此，如何將光敏基因通過病毒載體植入細胞并得到高表達性，還需要更多的研究去突破。同時，在臨床應用上，使用的病毒載體對人體產生的細胞毒性和免疫應答反應的程度、病毒載體的長期轉染對大腦的影響、遞送載體的替代和改良，以及設計出能夠安全插入大腦的探針等，都還需要不斷研究、優化。再者，光遺傳學作為近年來一個新興的跨越學科的研究技術，目前迫切需要掌握多門學科知識和技能的復合型研究人才對其進一步開發利用，這一限制也是這個領域的一大挑戰。

但相比其他治療神經損傷的技術，這項新興技術最大的優勢在于精準調控特定細胞和精確把控時間這兩方面，打破了傳統治療神經內科疾病的種種局限性，如傳統藥物治療時間長、效果不明顯且副作用大，電刺激法波及神經元范圍廣等缺點。同時，目前使用的傳統方法治療神經內科疾病不僅費用昂貴，多數家庭難以承受，而且預后效果欠佳，只能改善而不能阻止病情的發展，病人也因此有了嚴重的心理負擔，從而影響患者的生命質量。以光遺傳學技術作為新的突破口，這項近似無創治療的技術能降低開顱手術帶來的風險，且沒有副作用，從生理上和心理上都能極大地減輕患者的痛苦。選擇性的靶向治療也增大了治愈的可能性，甚至可能徹底根治疾病，提高患者的生命質量。光遺傳學理論和技術體系的建立，不僅是科技創新的一大重要成果，更為治療疾病提供了一種全新且更為精準的思路和方法。隨著越來越多的疾病發病機理被揭示，光遺傳學技術將會被應用到更多的疾病中去，尤其是與神經科學領域相關的疾病治療。目前已有大量研究表明［39-42］，光遺傳學技術在抑郁癥發病機制、心臟電生理、疼痛、睡眠焦慮、腫瘤、視網膜疾病、運動障礙、聽覺研究和成癮機制等研究領域有了新的突破，有望被應用于治療這些疾病。光遺傳學不僅為人們打開了精準控制神經元的新視野，同時也在疾病病理和治療方面提供了全新的方法，以幫助我們對自身健康和疾病進行更深層次的探索。