肺炎支原體的病原生物學研究進展

劉 瑤，廖國陽*

（1. 昆明醫科大學，昆明 650550；2. 中國醫學科學院北京協和醫學院醫學生物學研究所，昆明 650118）

肺炎支原體（Mycoplasma pneumoniae，MP）是一種能夠引起呼吸道感染的人類病原體［1］。據報道，支原體科支原體屬基因組是由普通革蘭氏陽性菌祖先經過減少基因組的方式進化而來的［2］。在自然界中已經鑒定出200 多種支原體，但只有少數幾種被證實可導致人類疾病，其中最重要的是MP。據統計，MP 可導致所有年齡段人群中高達40%的社區獲得性肺炎（community-acquired pneumonias，CAP），并可引起地區性流行［3］，在所有人群中普遍易感，其中對老人、兒童及免疫力低下人群危害更為嚴重。MP 感染不僅能引起發熱、干咳等臨床癥狀，還可引發多種并發癥［4］，造成機體多系統損傷［5］，如哮喘、慢性阻塞性肺疾病等［6］。與其他種類的呼吸道病原體不同的是，盡管付出了巨大的努力，但肺炎支原體的疫苗仍無法獲得［7］。

1 病原學特征

MP 呈單個紡錘形細胞，長1.0～2.0 μm，寬0.1～0.2 μm，二分裂方式繁殖，一般1～6 h分裂1代，可通過0.22 μm 的微孔濾膜，反復傳代后，顯微鏡下觀察菌落呈油煎蛋狀（圖1）［8］。MP 的基因組片斷大小為816 394 bp，含730 個編碼基因，約為大腸桿菌的1/6。MP 的基因組包含大量重復區域，稱為RepMP，約75%的RepMP與MPN141（P1）和MPN142（P40/P90）具有同源性。根據P1 蛋白上RepMP2/3和RepMP4重復序列的不同，MP 可分成M129型（I型）和FH 型（Ⅱ型）［9］。RepMP與MPN141或MPN142之間的同源重組可在P1 或P40/P90 的抗原區域內產生變異，是MP 逃避免疫宿主系統監視的重要策略［10］。MP 的基因組小，生物合成能力有限，不能自主合成固醇類物質。其分離培養對培養基的營養成分要求較高，常以牛心消化液為基礎培養基，加入酵母粉及動物血清混合制備。MP 對pH較為敏感，最適pH 為7.5～8.0，低于7.0 易死亡，且耐冷，在-70℃或液氮中菌株可被長期保存，在4℃保存不宜超過3 d。自然環境下，MP 需依賴宿主細胞提供營養生存，脫離宿主會迅速死亡，對于干燥的敏感性證實其只能通過飛沫傳播［8］。

2 致病機制

MP 的運動性和傳染性由免疫顯性蛋白P1 和P40/P90 形成的被稱為“Nap”的跨膜黏附復合物所介導［11］。目前研究表明，MP 的致病機制主要是感染后對宿主細胞的直接作用及引起機體的免疫病理損傷。

2.1 細胞黏附機制和分子機理

MP 對呼吸道細胞的黏附是其致病的主要原因，其與宿主上皮組織之間的緊密聯系是導致疾病的前提，通常缺乏黏附能力的MP 也缺乏致病力。MP 的黏附作用是由其頂端極化的黏附細胞器結構介導的（圖2）［12］。MP 的黏附作用和滑行運動由主要抗原蛋白P1 決定，其在呼吸道黏膜上的黏附和運動可被抗P1 抗體阻止［13］。P1 是與宿主細胞的唾液酸寡糖受體結合的主要抗原［14］。隨著研究的深入，Krause 等［15］還證實了MP 的黏附功能也需要其他輔助蛋白［高分子量（high molecular weight，HMW）、P40、P65 蛋白等］及分子伴侶蛋白（TopJ、Lon 蛋白等）的參與。P1 被認為是MP 細胞中免疫力最強的蛋白質之一，在感染患者的免疫反應、診斷以及流行病學研究中起著重要作用［16］。P30 蛋白的作用與P1 蛋白相似，缺失會導致MP 的黏附功能喪失［8］。P40/P90 由MPN142基因編碼的130 kD的蛋白水解切割得到的兩個多肽組成［17］。研究顯示，盡管P1 和P40/P90 大小不同，但兩種蛋白的緊密關系表明二者具有最近的共同系統發生祖先［18］。除Nap 成分以外的蛋白質，P30、P41、P65、HMW1、HMW2 和PrpC/PrkC 對于MP 在上皮細胞表面的黏附作用和滑行運動也十分重要。研究顯示，P41 和P24 對細胞生長和發育過程中附著細胞器裝配的正確時機和位置至關重要。若缺少P41，滑行過程中黏附細胞器會與自身胞體發生分離［19］。HMW 蛋白能維持和穩定黏附細胞器的正常結構，保證P1、P30 蛋白的聚集、活化和黏附等過程正常進行。P90蛋白與P40 蛋白能將P1 蛋白錨定于黏附細胞器的細胞骨架上。

圖1 肺炎支原體的顯微鏡照片Fig. 1 Microscopic view of Mycoplasma pneumoniae

圖2 黏附細胞器的結構模式圖Fig. 2 Structure of attachment organelle

除黏附損傷外，MP 感染產生的過氧化物會造成機體損傷。在遠源生物絲狀支原體絲狀亞種SC型（Mycoplasma mycoidessubsp.mycoidessmall colony，MmmSC）的研究中已經闡明了致病性與過氧化物形成之間的相關性［20］。MP 代謝甘油會導致過氧化物的產生［21］，這表明相同的代謝途徑可能導致肺炎支原體疾病的發生。此外，MP 產生的超氧陰離子可抑制宿主細胞中的過氧化氫酶，從而減少過氧化物的酶促分解，使宿主細胞更容易受到氧化損傷［22］。也有研究表明，MP 可通過對宿主細胞乳鐵蛋白的吸收，在細胞代謝中使鐵呈局部酸性的微環境，引入鐵絡合物產生高反應性羥基自由基，從而產生局部傷害，其中鐵代謝還包括過氧化氫和超氧陰離子［23］。除了直接的氧化損傷外，MP 產生的過氧化氫還可能激活酪氨酸激酶依賴性信號通路，從而導致免疫系統異常激活［24］。

2.2 MP 與宿主細胞相互作用和免疫損傷

MP 能掠奪宿主細胞的營養成分進行復制和融合，并分泌細胞毒素，產生過氧化氫及超氧化物等，造成細胞病理損傷，或引起宿主細胞凋亡。研究發現，在不適于MP 生長的培養液中共同培養Hela 細胞和MP，MP 可進行增殖，而Hela細胞則發生病變，提示MP 可通過掠奪Hela 細胞的營養成分生長［25］。MP 可進入人肝細胞內復制生長［26］，從而對肝臟組織造成傷害。MP 的MPN372基因編碼的毒素蛋白稱為社區獲得性呼吸窘迫綜合征毒素（community acquired respiratory distress syndrome toxin，CARDS TX），與MP 致病力密切相關，且該蛋白具有較強的免疫原性。細胞毒性包括對呼吸道上皮細胞的直接損傷作用［27］，破壞呼吸道黏膜的完整性，使宿主細胞空泡化。宿主細胞死亡后釋放胞內物質，引發炎癥破壞組織內穩態，產生過度免疫反應［28］。MP的脂質相關膜蛋白（lipid-related membrane proteins，LAMPs）可通過TLR-1/2 或TLR-1/2/6 信號通路活化核轉錄因子-κB（nuclear transcription factor-κB，NF-κB）［29］。在發酵支原體中已證實LAMPs 可刺激TLR-2/6，活化NK-κB，最終導致細胞凋亡，因此推測MP 能導致宿主細胞凋亡或與此相關［30］。

MP 感染相關最常見的免疫現象是周圍神經系統的損傷。研究顯示，約有5%～15%的格林-巴利綜合征病例與MP 感染相關［31］。MP 感染也與腦炎、急性脫髓鞘性腦脊髓炎和視神經炎的發生相關［32］。在一項針對近2 000 名腦炎患者的研究中，MP 被視為最重要的感染因子［33］，大約5%的病例顯示出急性MP 感染的證據，其中大多數為兒童。MP 感染宿主細胞后可介導吞噬細胞產生多種細胞因子介導非特異性免疫反應［34］。被MP 感染的人肺泡II 型肺細胞顯示，白細胞介素-8（interleukin-8，IL-8）、腫瘤壞死因子-a（tumor necrosis factor，TNF-a）和IL-1β mRNA 的產生增加［35］，這表明MP 對人呼吸道上皮細胞的黏附會導致細胞因子的產生及淋巴細胞和其他炎性細胞的募集，并且這些細胞因子隨后會調節炎性浸潤的進展。由于受到局部損傷，被MP 寄生的哺乳動物細胞可表現出多種細胞病變，如使宿主細胞失去纖毛、出現空泡狀，降低宿主細胞耗氧量、葡萄糖利用率、氨基酸吸收和大分子合成，最終導致宿主細胞死亡。這些局部損傷的臨床表現為如持續性咳嗽等的急性呼吸道癥狀。MP 被證實可直接激活免疫系統的細胞產生細胞因子。Kristen等［36］證明，在共培養試驗中，MP 可誘導肥大細胞產生IL-4，這主要取決于靶細胞膜和P1 黏附素上唾液酸殘基的存在。MP 感染后能直接激活和誘導宿主免疫細胞產生細胞因子。Yang 等［37］的研究證實MP ATCC-15531 菌株可直接誘導A549 和U937 細胞產生IL-1β。機體感染MP 后，可產生相應組織的自身抗體，形成免疫復合物激活補體，產生大量中性粒細胞趨化因子，募集白細胞引起溶酶體釋放出水解酶，導致破壞性病變及多系統損傷［38］。MP 感染會引起機體T 細胞亞群紊亂，Th1 型細胞免疫應答在MP 感染引起的病理損傷中起著重要作用［39］。MP 細胞膜上的糖脂類抗原可誘導體液免疫應答，CARDS TX 使小鼠產生特異性的IgE，使得哮喘加劇［40］。

MP 感染除誘發機體產生一系列特異性和非特異性免疫反應外，也會造成某些自身免疫反應，導致機體損傷。由于MP 和人體存在共同抗原，故其會引發機體自身免疫應答，導致多系統免疫損傷和肺外并發癥［41］。此外，P1 蛋白的抗原多態性降低了特異性抗體的作用，黏附結構能抵抗纖毛的清除作用，MP 具有的免疫抑制作用和共同抗原的存在使其能逃避宿主的免疫監視，不被吞噬細胞識別攝取［42］。部分肺炎支原體肺炎（Mycoplasma pneumoniaepneumonia，MPP）患者的T 淋巴細胞功能暫時性抑制和對肺炎鏈球菌等合并感染與此相關。小鼠感染MP 后，其吞噬細胞活性和IgG 水平下降，提示MP 具有一定的免疫抑制作用［43］。

3 診斷與治療

MP 感染的診斷方法包括MP 分離培養法、血清學抗體檢測法、抗原檢測法和核酸檢測法等［44］。MP 感染的病例活檢顯示，MP 患者有黏膜表面的上皮內膜潰瘍、支氣管和細支氣管的纖毛上皮潰瘍、支氣管和支氣管壁水腫等癥狀［45］，可作為MP 的臨床診斷依據。但MP 感染各組織器官及肺部病變特征不具典型性，因此難以根據臨床癥狀對MPP 進行確診［45］。早期MPP 臨床診斷常采用冷凝素測定法。該方法將疑似患有MPP 患者的血液收集于含抗凝劑試管中，冰浴30 s 后傾斜試管檢查凝集現象，但在鑒別診斷中，EB 病毒（epstein-barr virus，EBv）、立克次氏菌、流感病毒和腺病毒等感染也可誘導冷凝集素的產生［46］，因此該方法僅可作為MP 感染的參考。血清學檢測是目前國內外最常用的MP 感染診斷方法。培養法是檢驗MP 的最佳方法和金標準，但其培養要求高、條件苛刻、耗時長，多數臨檢單位未能建立完整的檢測體系，常用于回顧性診斷與研究，臨床價值有限。核酸檢測法有較好的特異性和靈敏性，可用于MP 感染的早期臨床診斷。Razin等［47］對各種基于分子手段的MP 診斷方法進行了概述。Waites 等［48］對MP 臨床診斷和藥敏試驗的最新方法進行了總結。但由于許多醫院設備不全，缺乏質控標準，使MP 臨床確診仍具挑戰性［49］。

目前臨床上針對MPP 的治療主要是抗生素治療、纖維支氣管鏡、免疫抑制劑等治療方法［50］。其中主要以大環內酯類抗生素治療為主，對于急性患者可通過免疫抑制劑控制炎癥反應，纖維支氣管鏡治療能有效檢查肺部局部病變情況。若大環內酯類抗生素治療無效果，需綜合考慮多種致病因素，進行MP 的耐藥性檢測，從而選擇敏感的藥物進行針對性治療［51］。目前我國抗大環內酯類抗生素的MP 耐藥菌耐藥率高達90%以上，耐藥形勢十分嚴峻［52］。因此，MP 疫苗研制是防治MP 感染的有效方案。

4 疫苗研究現狀

早期研究結果顯示，常規方法制備的MP 滅活疫苗對人體具有一定的保護作用。甲醛滅活的MP 疫苗輔以明礬佐劑注射后可降低肺炎和呼吸道感染的發生率［53］。但也有研究顯示，人類［54］和小鼠［55］中存在接種MP 疫苗后再次感染加劇病情的情況。陳楓［56］的研究顯示，傳代減毒株疫苗具有一定的保護效果，且通過鼻內免疫的效果要優于皮下免疫接種，提示黏膜免疫提供的免疫保護在抵御MP 感染中發揮重要作用。

P1 和P30 抗原是目前MP 基因工程亞單位疫苗的研究熱點。P1 蛋白是MP 表面抗原中目前被認為最具潛力的疫苗候選抗原。研究顯示，P1 蛋白編碼基因C'端編碼的蛋白具有較強的免疫原性，但相較于全菌體，其免疫原性低［57］。Vizarraga 等［18］在最新的研究中闡明了MP 中蛋白P1、P40/P90 以及與唾液酸化寡糖結合的P40/P90 復合物這些免疫優勢蛋白的抗原結構，其中對P1 的不同片段的血清學測試發現，IgG 抗體對保守區的識別偏好高于可變區，表明選擇這些保守區域進行疫苗設計是進行長期免疫的系統策略。值得注意的是，其結果還表明，來自P1 的C 末端結構域僅包含一個無序環，且沒有遺傳變異性。此外，P1 的全長細胞外區域被所有血清強烈識別，而與IgG 或IgM 的比例無關，這也證實了P1 的免疫優勢。這些結果表明，C 末端結構域可能是一個相對較弱或難以接近的抗原區域，說明該區域能夠有效產生特異性較強的抑制MP 黏附的IgG 抗體，提示該結構域的免疫原性具較高的研究意義。

有研究顯示，即便MP 疫苗在佐劑的作用下具有良好的免疫原性，刺激機體產生的抗體也并不能為機體提供有效保護。另外在注射疫苗完成免疫后，再次感染MP 時，往往會出現免疫激化的現象，從而導致機體損傷［58］。這些都是目前MP 疫苗研發過程中亟待解決的問題。

5 總結與展望

當前國內外雖然對MP 的研究較為深入，但針對支原體的病原學研究相對較少。關于支原體分離和鑒定標準的制定、菌種庫的建立、精準檢測方法的實施等的研究對于MP 感染的診斷十分重要。MP 在所有人群中普遍易感，并可導致兒童重癥肺炎和老年組人群的慢性阻塞性肺炎（chronic obstructive pulmonary disease，COPD），從而危及生命，縮短人均預期壽命。尤其是對于MP 耐藥菌株或多重耐藥菌的感染，其臨床治療非常困難。因此目前急需建立針對MP 感染的早期快速診斷方法。另外，針對其他動物感染的支原體早已有商業化的疫苗上市，并且得到了廣泛的使用，因此，應加強人用新型治療性藥物和安全有效的人用MP 疫苗的研發。綜上所述，進一步深入MP 基礎研究、建立快速可靠的檢測方法、加強MP 疫苗的研發對于MP 的預防控制及治療刻不容緩。