聚乙二醇化黑色TiO2介導的光動力療法滅活HL60細胞試驗研究

張啟云，林舒欣，方 杰，李淼淼，肖睦滄，艾保全，熊建文

（華南師范大學物理與電信工程學院，廣州 510006）

癌癥是一個全球性問題，給人類社會帶來了越來越大的健康和經(jīng)濟負擔［1］。白血病是兒童最常見的癌癥［2］。傳統(tǒng)化療和放療療效低，通常伴有副作用［3］。光動力療法（photodynamic therapy，PDT）作為一種微創(chuàng)、有效且可與其他治療方法聯(lián)合使用的醫(yī)療技術，在臨床研究和實踐中都已成為一種極具吸引力的癌癥治療方法［4-5］。PDT 的原理是：通過特定波長的光激發(fā)在腫瘤內(nèi)積累的光敏劑，分解組織中的H2O 和O2，產(chǎn)生活性氧（reactive oxygen species，ROS），損害腫瘤細胞［6］。

納米顆粒作為可能的光敏劑被廣泛應用于PDT 研究中。其包含直徑小于100 nm 的納米球和納米囊，合適的大小延長了其在血液中的循環(huán)時間［7］。納米顆粒的高通透性和滯留效應（enhanced permeability and retention effect，EPR）使得其特異性地擴散和保留到腫瘤細胞中［8］。其比表面積較大，能為PDT 提供更大的反應面積［9］。TiO2納米顆粒不僅具有一般納米材料的特性，而且在紫外光下催化活性良好、低毒、醫(yī)用性能穩(wěn)定、制備簡單、價格低廉，是一種潛在光敏劑［10-12］。然而TiO2納米顆粒也存在一些缺點：僅受紫外線激發(fā)，而紫外光本身對人體有危害；在生理環(huán)境中分散性差［13-14］。

TiO2改性一直是研究熱點。研究人員主要通過金屬、非金屬、有機物摻雜改性TiO2的光響應范圍，避免了紫外線激發(fā)的誘變問題，但TiO2對可見光的吸收仍然不足［15］。近些年發(fā)現(xiàn)的黑色二氧化鈦（B-TiO2）在不引入其他雜質(zhì)的情況下，通過自身還原在表面引入缺陷，從近紅外到紫外表現(xiàn)出高效的光吸收特性，在可見光下表現(xiàn)出高催化性，已廣泛應用于水凈化、水分解、超級電容器和燃料電池等多個領域，但作為光敏劑在PDT 領域的報道較少［16-18］。B-TiO2幾乎都是通過氫化還原、鋁熱還原、硼氫化鈉還原來制備的，這些方法需要嚴格的大氣條件或較高的溫度［19］。例如Zhou 等［20］在500℃下加氫3 h，合成了B-TiO2納米顆粒；Ye 等［21］在600℃氬氣環(huán)境下，通過金屬鎂還原P25 得到B-TiO2納米顆粒。用簡單的方法制備B-TiO2是促進其應用的重要因素。

本文采用水熱還原法制備B-TiO2，并通過聚乙二醇化來提高B-TiO2的分散性、生物相容性［22］。此外，通過對比TiO2、B-TiO2、PEG@B-TiO2納米顆粒體外PDT 殺傷白血病細胞（HL60 細胞）的效果，評估PEG@B-TiO2作為光敏劑滅活白血病細胞的能力，并對其療效進行了比較全面的機理分析。結果表明，PEG@B-TiO2納米顆粒在體外對HL60 細胞具有低暗毒性和高光動力滅活效率，在未來的光動力治療領域具有廣闊的應用前景。

1 材料與方法

1.1 細胞株

HL60 細胞由中國人民解放軍軍事醫(yī)學科學院生物工程研究所提供。

1.2 試劑與儀器

四氯化鈦（TiCl4），抗壞血酸（C6H8O6），聚乙二醇（polyethylene glycol，PEG，相對分子質(zhì)量為6 000），氫氧化鈉（NaOH），完全RPMI-1640 培養(yǎng)基（美國Gibco），活性氧檢測試劑盒（北京普利來），細胞計數(shù)試劑盒（cell counting kit-8，CCK-8）溶液（日本同仁化學研究所），臺盼藍（美國Invitrogen），雙蒸餾水。本研究中使用的所有化學品均為分析級。

X 射線粉末演示儀（德國Bruker），JEM-2100HR透射電子顯微鏡（日本JEOL），UV-1700 紫外可見分光光度計（日本Shimadzu），WFY-28 型熒光分光光度計（天津拓普），CountessTM型自動細胞計數(shù)儀（美國Invitrogen），納米粒度分析儀（美國麥克儀器），酶標儀（美國Bio Rad），二氧化碳培養(yǎng)箱（上海一恒科技），低速臺式離心機（上海安亭），PDT 反應室（自行設計，410 nm光源），96孔板及細胞計數(shù)板等。

1.3 試驗方法

1.3.1 B-TiO2的制備

稱量7.00 g 抗壞血酸放入70.0 mL去離子水中，攪拌10 min 后加入3.1 mL TiCl4，并滴加NaOH 溶液（1 mol/L）至混合溶液的pH 為4。攪拌30 min 后倒入反應釜中，180℃恒溫12 h，待冷卻后用去離子水、無水乙醇分別離心洗滌3次，80℃干燥8 h。

1.3.2 PEG@B-TiO2的制備

稱量0.10 g B-TiO2放入100.0 mL 無水乙醇中，制備3 份并超聲2 h，分別加入0.05、0.10、0.20 g PEG，各自在室溫下攪拌24 h 后離心洗滌；沉淀物分別置于40℃恒溫烘箱干燥12 h，得到不同修飾比例的PEG@B-TiO2納米復合顆粒。其中，PEG 添加量為0.05 g 時，PEG 與B-TiO2的質(zhì)量比為1∶2，得到的納米復合顆粒記為PEG@B-TiO2-0.5；PEG 添加量為0.10 g 時，PEG 與B-TiO2的質(zhì)量比為1∶1，得到的納米復合顆粒記為PEG@B-TiO2-1；PEG 添加量為0.20 g 時，PEG 與B-TiO2的質(zhì)量比為2∶1，得到的納米復合顆粒記為PEG@B-TiO2-2。

1.3.3 光敏劑的表征

通過X 射線衍射（X-ray diffraction，XRD）分析晶體結構和晶體粒徑；用透射電鏡（transmission electron microscopy，TEM）表征納米顆粒的形貌、尺寸和分散性；通過粒度儀分析納米顆粒的水合粒徑；用紫外可見吸收光譜（ultraviolet and visible spectrum，UV-VIS）測定材料的光響應區(qū)；用熒光光譜（fluorescence spectra，F(xiàn)S）顯示材料的電子空穴復合率；用傅里葉紅外光譜（fluorescence spectra，F(xiàn)TIR）研究材料的官能團。

1.3.4 HL60細胞的培養(yǎng)

將HL60 細胞置于含10%新生牛血清的完全RPMI-1640 培養(yǎng)基中，并放入37℃且含95%空氣和5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.3.5 細胞懸液的制備

將對數(shù)期細胞換液并分散均勻，取20.0 μL細胞液與20.0 μL臺盼藍混合后滴入計數(shù)板，用CountessTM計數(shù)并計算。將細胞液稀釋至濃度為2×104個/cm2，即可得到試驗所需的細胞懸液。

1.3.6 體外毒性試驗

設置96 孔培養(yǎng)板A、B 板，A 板為光照板，B 板為遮光板，每個板都設置試驗組、對照組和調(diào)零組。為了避免隨機誤差，同一條件設置3 個復孔。在各板試驗組、對照組加入100.0 μL 細胞懸液，調(diào)零組只加培養(yǎng)基，之后放入培養(yǎng)箱共孵育24 h。拿出A、B 板，試驗組加入100.0 μL 不同質(zhì)量濃度的TiO2、B-TiO2、PEG@B-TiO2-0.5、PEG@B-TiO2-1、PEG@B-TiO2-2，在對照組和調(diào)零組分別加入100.0 μL 培養(yǎng)基，各板酒精消毒后放入培養(yǎng)箱孵育12 h。然后將A 板放入光動力反應室1 h 后繼續(xù)置于培養(yǎng)箱12 h，B 板則一直置于培養(yǎng)箱避光處理。隨后在A、B 板每孔中加入20.0 μL CCK-8 試劑，放入培養(yǎng)箱2 h 后拿出，用酶標儀在450 nm 處測吸光度（optical density，OD）。根據(jù)（1）式計算細胞存活率，（2）式計算PDT 效率。

式中：R表示細胞存活率；η表示PDT 效率；ODtreat為試驗組的吸光度；ODcontrol為對照組的吸光度；ODblank為調(diào)零組的吸光度；ODirradiation為光照板的吸光度；ODwithout-irradiation為遮光板的吸光度。

1.3.7 ROS檢測

將1.5 mL 細胞懸液分別與1.5 mL 質(zhì)量濃度為320 μg/mL 的TiO2、B-TiO2、PEG@B-TiO2-0.5、PEG@B-TiO2-1、PEG@B-TiO2-2 混合后，放入培養(yǎng)箱共孵育24 h；接著用磷酸緩沖液（phosphate buffer saline，PBS）洗滌2 次，取細胞沉淀，分別滴加1.5 mL 10 μmol/L 的活性氧熒光探針（2，7-dichlorodihydrofluorescein diacetate，DCFH-DA），孵育30 min；然后PBS 洗滌2 次，重懸于新鮮培養(yǎng)基中，除去未進入細胞的熒光探針；PDT 1 h 后，PBS 洗滌，重懸細胞，用熒光分光光度計測量細胞的熒光強度。

1.3.8 數(shù)據(jù)分析

試驗數(shù)據(jù)用Origin 9.0、SPSS 24.0 軟件處理，結果以“平均值±標準差”形式表示；在所有統(tǒng)計分析中，P≤0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果與分析

2.1 納米顆粒的表征

2.1.1 TEM分析

圖1 為B-TiO2、PEG@B-TiO2的TEM 圖。從圖1中可以看出B-TiO2、PEG@B-TiO2納米顆粒均呈球形。通過Nano measurer 1.2軟件分析可得到B-TiO2、PEG@B-TiO2-0.5、PEG@B-TiO2-1、PEG@B-TiO2-2 的平均粒徑分別為4.35、4.57、5.63、5.50 nm，符合光敏劑進入細胞的尺寸要求。由圖1a～1c 可知，與B-TiO2相比，PEG@B-TiO2分散性較好，說明PEG 修飾可以提高B-TiO2的分散性。由圖1d可知，晶格條紋間距0.35 nm對應于TiO2的（101）晶面，B-TiO2表面包覆了非晶層外殼，說明PEG@B-TiO2納米復合顆粒形成。如圖2a～2d 所示，B-TiO2、PEG@B-TiO2選區(qū)電子衍射環(huán)數(shù)據(jù)一致，根據(jù)JCDPS 數(shù)據(jù)庫中21-1272 號銳鈦礦的標準電子衍射環(huán)數(shù)據(jù)，衍射環(huán)從內(nèi)到外分別對應（101）、（004）、（200）、（105）晶面，說明B-TiO2、PEG@B-TiO2都是多晶體，且PEG 的加入不影響B(tài)-TiO2的晶型。

2.1.2 水合粒徑分析

圖1 制備的納米顆粒的透射電鏡圖Fig. 1 Transmission electron microscopy images of the prepared nanoparticles

圖2 制備的納米顆粒的選區(qū)電子衍射圖Fig. 2 Selected area electron diffraction images of the prepared nanoparticles

圖3 為B-TiO2、PEG@B-TiO2的水合粒徑圖。由于合成的納米顆粒在水溶液中發(fā)生團聚，因此水合粒徑偏大。與B-TiO2相比，PEG@B-TiO2水合粒徑較小，說明聚乙二醇化提高了B-TiO2的分散性。

2.1.3 XRD分析

如圖4 所示，TiO2、PEG@B-TiO2均在2θ為25.51°、38.18°、48.12°、53.89°、55.17°、62.87°、68.97°、70.56°、75.46°處出現(xiàn)衍射峰，分別對應于銳鈦礦的（101）、（004）、（200）、（105）、（211）、（204）、（116）、（220）和（215）晶面，說明抗環(huán)血酸還原和聚乙二醇化沒有改變B-TiO2的晶體結構，這與TEM結論一致。（3）式（謝樂公式）如下：

圖3 B-TiO2和PEG@B-TiO2的水合粒徑圖Fig. 3 Hydration particle size images of B-TiO2 and PEG@B-TiO2

圖4 TiO2、B-TiO2、PEG@B-TiO2的X射線衍射光譜Fig. 4 X-ray diffraction spectra of TiO2, B-TiO2, PEG@B-TiO2

式中，D表示平均晶粒大小，K為常數(shù)0.89，λ為X 射線波長，B為半波峰寬度，θ為布拉格角。根據(jù)（3）式可求出TiO2、B-TiO2、PEG@B-TiO2-0.5、PEG@B-TiO2-1、PEG@B-TiO2-2 納米顆粒的平均晶粒大小分別為22.1、3.0、4.2、5.6、5.4 nm，說明PEG修飾可增加B-TiO2的結晶度，且PEG@B-TiO2-1 的結晶度最高。

2.1.4 FTIR 分析

圖5 為B-TiO2、PEG@B-TiO2的FTIR 圖。對于B-TiO2，其在400～600 cm-1的特征峰歸因于Ti-O 鍵的振動，在3 429 cm-1的吸收峰歸因于羥基（-OH）的振動；PEG 在1 110、2 889、3 435 cm-1的吸收峰分別是由C-O、C-H、-OH 振動引起的；PEG@B-TiO2的FTIR 曲線出現(xiàn)Ti-O、C-H 的吸收峰，表明PEG與B-TiO2成功復合；與B-TiO2相比，PEG@B-TiO2的-OH 吸收峰面積減小且發(fā)生位移，表明PEG 能與B-TiO2通過表面羥基形成的氫鍵結合。

2.1.5 UV-VIS 分析

圖5 B-TiO2、PEG、PEG@B-TiO2的傅里葉紅外光譜Fig. 5 Fourier infrared spectrum of B-TiO2, PEG, PEG@B-TiO2

圖6 納米顆粒的紫外可見吸收光譜和激發(fā)光譜Fig. 6 Ultraviolet and visible spectrum and excitation spectra of nanoparticles

圖6a 顯示了納米顆粒的紫外可見吸收光譜，TiO2在可見光區(qū)吸收值接近0，而B-TiO2、PEG@B-TiO2在可見光區(qū)都有較強的響應，且吸光度隨著波長的增加而降低。圖6b 顯示了PEG@B-TiO2納米顆粒的激發(fā)光譜，由圖可知，納米顆粒的激發(fā)峰在410 nm 處。為了獲得較高的PDT 效應，體外PDT 試驗采用410 nm 可見光。TiO2、B-TiO2、PEG@B-TiO2-0.5、PEG@B-TiO2-1、PEG@B-TiO2-2在410 nm 處的吸光度分別為0.07、0.98、1.00、1.02、1.05，說明B-TiO2顯著提高了TiO2在410 nm 處的吸光度。相對B-TiO2，PEG@B-TiO2吸光度降低了2.0%～6.6%，說明PEG 加入基本不影響B(tài)-TiO2在410 nm 處的吸收。提高納米顆粒在410 nm 處的吸收，有利于誘導產(chǎn)生更多的電子空穴，提高光催化效率。

2.1.6 FS分析

熒光強度的高低對應電子空穴復合率的高低。阻礙電子空穴的復合可以推進光催化分解H2O 和O2，產(chǎn)生大量的ROS。圖7 為不同納米顆粒的FS圖，熒光強度呈現(xiàn)：TiO2＞ B-TiO2＞ PEG@B-TiO2-0.5＞PEG@B-TiO2-2＞ PEG@B-TiO2-1。這表明，相比TiO2，B-TiO2更有利于電子空穴的分離。聚乙二醇化進一步抑制了電子空穴的復合，其中PEG@B-TiO2-1 電子空穴復合率最低，為其改進PDT 效率提供了依據(jù)。

圖7 TiO2、B-TiO2、PEG@B-TiO2的熒光光譜Fig. 7 Fluorescence spectra of TiO2, B-TiO2, PEG@B-TiO2

2.2 細胞試驗分析

2.2.1 體外暗毒性試驗分析

在PDT 中，關鍵是要避免光敏劑在沒有光照下被激活，否則將導致無法控制的危險和副作用。因此，我們先研究了沒有光驅(qū)動的情況下TiO2、B-TiO2、PEG@B-TiO2納米顆粒對HL60 存活率的影響。如圖8 所示，細胞存活率隨著納米顆粒質(zhì)量濃度的增大而減小，說明納米顆粒對細胞存活率的影響呈劑量依賴性；當納米顆粒質(zhì)量濃度為320 μg/mL 時,細胞存活率依然保持在80%以上，說明納米顆粒暗毒性較低；相比B-TiO2，PEG@B-TiO2的細胞存活率明顯提高；在質(zhì)量濃度為20 μg/mL時，PEG@B-TiO2-2 的細胞存活率比B-TiO2高5.7%，說明PEG 的引入降低了B-TiO2的暗毒性，從而提高了B-TiO2的生物相容性。

圖8 無光照時TiO2、B-TiO2、PEG@B-TiO2納米顆粒對HL60細胞的毒性（P＜0.05）Fig. 8 Toxicity of TiO2, B-TiO2, PEG@B-TiO2 nanoparticles in the absence of light to HL60 cells (P＜0.05)

2.2.2 體外PDT 試驗分析

不同納米顆粒的PDT 效率曲線如圖9 所示。納米顆粒的PDT 效率隨著質(zhì)量濃度的增加而提高，當質(zhì)量濃度大于160 μg/mL 時，PDT 滅活效率增長緩慢，這可能是由于納米顆粒質(zhì)量濃度略高，減緩了細胞對納米顆粒的攝取。在相同條件下，B-TiO2的PDT 效率比TiO2提高了19.0%～45.0%，B-TiO2、PEG@B-TiO2的滅活效率呈現(xiàn)：PEG@B-TiO2-1＞PEG@B-TiO2-0.5＞ PEG@B-TiO2-2＞ B-TiO2。說明相比TiO2，B-TiO2光毒性顯著提高，PEG 修飾進一步提高了B-TiO2的光毒性，且當PEG 與B-TiO2質(zhì)量比為1∶1 時滅活效果最佳，當質(zhì)量濃度為320 μg/mL時，PEG@B-TiO2-1 的PDT 滅活效率高達81.8%。

2.2.3 ROS熒光光譜分析

圖9 TiO2、B-TiO2、PEG@B-TiO2納米顆粒光動力滅活HL60細胞效率（P＜0.05）Fig. 9 The efficiency of photodynamic inactivation of cells by TiO2, B-TiO2, PEG-B-TiO2 nanoparticles (P＜0.05)

圖10 TiO2、B-TiO2、PEG@B-TiO2納米顆粒作用下活性氧水平的檢測Fig. 10 Detection of reactive oxygen species under the action of TiO2, B-TiO2 and PEG@B-TiO2 nanoparticles

PDT 通過光敏劑的光催化反應會產(chǎn)生ROS，而ROS 誘導的細胞質(zhì)蛋白和細胞器損傷是導致細胞死亡的主要原因，因此，研究納米顆粒產(chǎn)生ROS 的能力是有必要的［23］。ROS 檢測采用的DCFH-DA染色劑在ROS 存在下可以快速氧化成高熒光物質(zhì)2，7-二氯熒光素（2，7-dichlorofluorescei，DCF），其在最大波峰處（510～550 nm）的熒光強度與ROS產(chǎn)量成正比。如圖10a、10b 所示，DCF 最大波峰在513 nm；在PEG@B-TiO2-1、PEG@B-TiO2-0.5、PEG@B-TiO2-2、B-TiO2、TiO2納米顆粒作用下，513 nm 處熒光強度依次降低，這說明抗壞血酸還原提高了TiO2的ROS 產(chǎn)量，而PEG 修飾進一步提高了B-TiO2的ROS 產(chǎn)量，且PEG@B-TiO2-1 的ROS 產(chǎn)量最高。這與PDT 試驗結果趨勢一致，也驗證了ROS 是滅活細胞的主要原因。

3 討論

ROS 是光敏劑在光催化反應中的產(chǎn)物，PDT 效率主要取決于細胞內(nèi)ROS 的產(chǎn)量。下列公式顯示了PEG@B-TiO2光催化過程的反應機制：

在光照下，光敏劑吸收能量不小于帶隙的光子，在導帶產(chǎn)生激發(fā)態(tài)電子，在價帶產(chǎn)生激發(fā)態(tài)空穴，這些激發(fā)態(tài)電荷可能彼此分離并遷移到光敏劑表面，與周圍的H2O、O2發(fā)生氧化還原反應，生成OH·、O2·、H2O2等活性氧物質(zhì)，以此來殺死白血病細胞［24］。在電荷分離和遷移的過程中，一些激發(fā)態(tài)電荷可能會重新結合或消失［25］。因此，促進電子空穴產(chǎn)生和阻礙電子空穴復合是實現(xiàn)高催化活性的關鍵［26］。材料吸收的光子越多，產(chǎn)生的激發(fā)電荷就越多，材料的熒光強度越低，電子空穴復合率越低，因此，提高材料光催化活性的關鍵是提高吸光度、降低熒光強度。通過UV-VIS 分析和FS 分析可知：相比TiO2，B-TiO2在410 nm 處的吸光度明顯增強，且熒光強度降低；聚乙二醇化基本不影響B(tài)-TiO2在410 nm 處的吸收，但降低了B-TiO2的熒光強度，且PEG@B-TiO2-1 熒光強度最低。這解釋了PDT 試驗結果：B-TiO2納米顆粒的PDT 效率相對TiO2顯著提高；PEG@B-TiO2進一步提高了PDT 效率；PEG@B-TiO2-1 納米顆粒PDT 滅活效果最佳。除此之外，根據(jù)TEM 分析和XRD 分析結果可知，PEG@B-TiO2結晶度較高、分散性好，這對光催化活性也有積極作用［27］。

綜上所述，TiO2、B-TiO2、PEG@B-TiO2納米顆粒的暗毒性低，PEG 修飾降低了B-TiO2的暗毒性。相比TiO2，B-TiO2光毒性明顯增強。PEG 修飾進一步提高了PDT 滅活效率，這歸因于PEG@B-TiO2納米平臺的以下優(yōu)點：可見光區(qū)吸收強，有效抑制電子空穴的復合，結晶度高，分散性較好。PEG@B-TiO2-1 介導的PDT 滅活效果最佳，在質(zhì)量濃度為320 μg/mL 時，PDT 效率高達81.8%。總之，我們成功制備了低毒、高催化活性的PEG@B-TiO2納米復合顆粒，且制備方法簡單、成本低，為PEG@B-TiO2未來作為有效光敏劑治療癌癥提供了試驗基礎，證明了TiO2在PDT 中具有潛在的應用前景。