光學相干成像技術無創監測Er:YAG激光消融后人牙本質表面變性層

曾素娟，藍銀濤，高偉健，黃文燕，舒 焱，葛立宏*，張 建*

（1. 廣州醫科大學附屬口腔醫院兒童口腔科，廣州市口腔再生醫學基礎與應用研究重點實驗室，廣州 510182；2. 廣州醫科大學基礎醫學院生物醫學工程系，廣州 511436）

1997 年，摻鉺釔鋁石榴石（Er:YAG，簡稱“鉺”）激光獲得食品和藥物管理局（Food and Drug Administration，FDA）批準，作為牙體硬組織的激光應用于臨床。其波長為2 940 nm，在水及羥基磷灰石OH-的吸收峰附近。水吸收激光能量后瞬間汽化，體積劇烈膨脹，產生微爆破，從而達到去除組織的效果［1］。由于齲壞組織的含水量高于健康組織，Er:YAG 激光能選擇性地去除齲壞組織。與傳統渦輪機相比，其在牙體預備過程中不接觸組織、無震動、噪聲小，對硬組織有鎮痛作用，使患者更舒適，減少患者的焦慮，尤其適用于牙科恐懼癥的患者［2］。Er:YAG 激光消融硬組織建立在光熱機械作用的基礎上。在使用Er:YAG 激光時，不應忽視牙體硬組織熱損傷的危險。熱分析研究顯示，有機成分、水分子和碳酸鹽在300℃以下即可發生熱改性［3］。無機和有機成分的變化可影響牙體硬組織的滲透性、溶解性或黏附性［4］。深入研究受激光影響的牙本質，特別是表面下層的結構特性，有利于指導臨床口腔醫生為激光處理后的牙本質選擇合適的粘接方法，進而提高修復效率。大部分傳統評估熱損傷的方法，如組織學和掃描電鏡（scanning electron microscopy，SEM），屬于破壞性的檢測，需進行樣品脫鈣、脫水、切片等，處理步驟繁瑣且需消耗大量的樣本以及成本［5-6］，不能直接應用于臨床病例。因此有必要開發一種能夠實時和無創評估牙本質特征的監測工具。

光學相干層析成像（optical coherence tomography，OCT）是一種實時、無創、高分辨率的光學成像手段。其信號對比度源于生物組織或材料光學反射（散射）特性的空間變化，可以快速形成包含樣本斷面結構的二維或三維影像［7-10］。在牙科領域中，OCT 已被應用于隱匿齲、牙齒-充填體復合界面完整性和牙齒裂紋等的檢測［11-13］。在組織結構一致的前提下，OCT 圖像呈現出相同的灰度值。樣品對光的折射率隨著組織結構變化而變化，OCT 圖像隨之顯示出不同的灰度值，從而揭示出不同的生物學特性［14］。基于這一理論，本研究應用OCT分析短脈沖Er:YAG 激光照射后牙本質的結構變化情況，并與組織學進行比較。

1 材料與方法

1.1 試驗設備

鉺-釹雙波長激光器（Fotona，斯洛文尼亞，美國）；正置顯微鏡（DM4，Leica，Wetzlar，德國）；SEM（S-3 400N II，Hitachii，日本）；X射線能量色散譜（energy dispersive X-ray，能量色散X 射線光譜儀（energy dispersive X-ray spectroscopy，EDX），550i，IXRF Sytems，Austin TX，美國）。

1.2 處理樣本

本試驗樣品為因阻生拔除的完整的人類第三磨牙，離體牙納入的標準為無齲壞、無氟斑、無釉質發育不全和非四環素牙。拔牙后用手工潔治器刮除牙體上的軟組織和色素，置于1%氯胺T 溶液4℃中保存。使用高速渦輪機金剛砂車針在水噴霧下去除冠部釉質層，暴露中層牙本質，用320、800、1 200、2 500 目砂紙在流水下拋光60 s，在30 倍體視顯微鏡下觀察，確保無釉質殘留；棄去表層有裂紋的牙塊，從釉牙骨質界下2 mm 處切斷牙根，去除牙髓，超聲波振蕩清洗20 min，得到牙本質圓盤，置于0.9%生理鹽水中室溫下保存，1 周內用于試驗。本項目已通過廣州醫科大學附屬口腔醫院醫學研究倫理會審查（倫理審批編號：KY2019002）。

1.3 試驗分組

將牙本質圓盤隨機分為6 組，每組10 個樣本，分組如下：1）砂紙組 經1.2 方法處理后的牙本質圓盤即為砂紙組。2）球鉆組 高速渦輪機上金剛砂球鉆在水冷卻下切削牙本質表面。每5 次預備后更換新的球鉆。3）Er:YAG 激光組 試驗光源為Er:YAG激光，脈沖頻率為0～50 Hz（可調），激光光束通過關節臂傳輸后經透鏡直接聚焦于組織樣品上，光斑直徑為1.3 mm。激光消融參數：能量為100 mJ，頻率為20 Hz，脈沖寬度為50 μs。在連續水噴霧下，在距靶點1.0 mm 的非直接接觸模式下用R14 型手持設備進行激光傳輸，移動激光手具切削牙本質表面。4）砂紙+酸蝕組 將樣品吹干，去除多余的水分，37%磷酸蝕刻30 s，水霧沖洗30 s。5）球鉆+酸蝕組 按球鉆組中的方法處理牙本質表面后，37%磷酸蝕刻30 s，水霧沖洗30 s。6）激光+酸蝕組 按Er:YAG 激光組中的方法處理牙本質表面后，37%磷酸蝕刻30 s，水霧沖洗30 s。

樣品表面處理完畢后，每組隨機抽取樣件分別進行后續檢測。

1.4 光學相干層析成像技術檢測

牙本質表面處理完成后，通過OCT 系統獲取處理后牙本質表面的截面圖。試驗所用的OCT系統的中心波長λ0=840 nm，帶寬Δλ=40 nm，功率P=5 mW，橫向和軸向分辨率約為7.24 μm。圖1 為本研究使用的定制的譜域光學相干層析成像（spectral-domain optical coherence tomography，SD-OCT）系統。

1.5 牙本質病理切片制備及蘇木精-伊紅化學染色

將OCT 檢測后的牙本質樣本浸入4%多聚甲醛中固定48 h，流水下沖洗過夜；經乙二胺四乙酸（ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA）脫鈣液浸泡21 d，流水下沖洗4 h 后脫水，并用石蠟包埋。每個石蠟包埋標本均切成4 μm 連續切片。將切片烘干后，用二甲苯脫蠟、加入梯度乙醇直至水化，再用蒸餾水清洗，然后進行蘇木精-伊紅（hematoxylineosin，H&E）染色，中性樹脂封片。將切片正置顯微鏡下觀察并拍攝照片。

1.6 SEM 及X 射線能量色散譜檢測

圖1 本研究中使用的SD-OCT成像系統（a）和牙本質盤（b）Fig. 1 SD-OCT imaging system (a) used in this study and the photograph of a dentin plate (b)

樣品經常規固定、干燥、噴金，用SEM 分析牙本質組織微結構變化，放大倍數為1 000、3 000，加速電壓為15 kV。用安裝在SEM 上的EDX 檢測消融牙本質元素的組成，每個樣本隨機選取3～4 個激光照射區域和正常牙本質組織區域，測定鈣（Ca）、磷（P）元素的含量（單位：atomic percentage，at %），并計算鈣磷比例。

1.7 統計學分析

本研究的試驗數據采用One-Way ANOVA 分析及Kruskal-Wallis 檢驗，以P＜0.05 為差異具有統計學意義。

2 結果與分析

在OCT 圖像上，所有試驗組牙本質表層光散射特性均發生改變，可見高亮層形成，光強度隨著深度的加深而減弱，牙本質表層及下層組織呈現出不同的灰度值（圖2），表層組織具有較淺的灰度（較高的散射強度），下層組織的灰度值較暗（較低的散射強度），表明牙本質表層與下層組織的結構特性發生了改變。組織學結果表明：激光組牙本質表層有不規則邊界的連續薄變化層（被蘇木精深染，嗜堿性），沒有明確的結構；球鉆組牙本質表面可觀察到不連續的薄變化層；經砂紙處理的牙本質表面光滑，染色最淺。H&E 染色觀察到的薄染色層與OCT表面的高亮層結果一致。

定量結果（圖3、4）顯示，受Er:YAG 激光影響的牙本質改性層厚度明顯高于砂紙和球鉆組（P＜0.05），表明Er:YAG 激光誘導的牙本質變性程度強于其他兩組。在空氣和組織折射率不同的基礎上，OCT 測量的組織厚度大于其實際值，但兩者間存在顯著的正線性相關性［14］。經過一系列的數學轉換，可以計算得出牙本質修飾層的真實厚度。

圖2 牙本質組織的OCT 圖像（左）和相應的組織學圖像（右）Fig. 2 The OCT images (left) and the corresponding histological images (right) of dentin tissue

圖3 OCT強度分布圖Fig. 3 The OCT intensity profile

基于Er:YAG 激光切削硬組織的光熱及光蝕理論，Er:YAG 激光切削可能導致牙本質化學結構的變化［15］，從而導致OCT 圖像中高亮層的出現。關于受激光影響的牙本質深度，霍曉等［6］和Ceballos等［15］通過投射電鏡（transmission electron microscope，TEM）分析發現Er:YAG 激光照射后牙本質表面形成了3～5 μm 厚的修飾層。在光學顯微鏡研究中，Almehdi 等［16］觀察到激光處理后牙骨質表面形成了深染的嗜堿性層，而在球鉆處理后的組織表面未見深染的嗜堿或嗜酸性層。該作者推測表面變性層是由激光熱效應引起的。據報道，選擇適當的Er:YAG 激光參數有助于降低牙本質組分的熱效應。與傳統評估牙本質表面下層性質的方法相比，OCT具有非電離、無創、實時、重復性好等優點［5-6］。由此可見，OCT 技術可輔助臨床醫生選擇合適的Er:YAG 激光參數，減少臨床中不必要的熱損傷。然而，值得注意的是，通過OCT 圖像無法解釋不同灰度層相對應的組織結構［5］。為了進一步研究受影響層的耐酸性能，指導臨床磷酸蝕刻時間，本研究接下來進行了SEM 和EDX 光譜分析。

SEM 結果（圖5）顯示：激光組的牙本質表面呈鱗片狀不規則形態，無玷污層，牙本質小管開放，呈袖口狀突出；磷酸處理后，牙本質小管開口擴大，未見明顯的膠原纖維網暴露；砂紙組及球鉆組的牙本質表面可見玷污層覆蓋，牙本質小管封閉；磷酸處理后，牙本質表面無玷污層，牙本質小管呈漏斗狀開放，膠原纖維網暴露。

EDX 結果（表1）顯示：激光+酸蝕組的鈣含量、磷含量在所有酸處理組中最高（P＜0.05），這表明激光處理后的牙本質變得更耐酸；砂紙組及球鉆組間鈣、磷含量均無統計學差異（P＞0.05）。所有試驗組間鈣磷比例無統計學差異（P＞0.05），表明牙本質的羥基磷灰石（hydroxyapatite，HA）晶體未發生變性或重建。

圖4 OCT 圖像上的牙本質高亮層的厚度結果Fig. 4 The thickness of the layer with high image intensity generated on the dentin in the OCT analysis

由于HA 晶體中鈣和磷原子的比例是相對恒定的［4］，根據Ca/P 的比值可推測HA 的晶體結構。據文獻報道，Er:YAG 激光能量密度低于7 J/cm2時，牙齒表面最高溫升約有300℃［17］。在本研究中，激光輸出能量劑量（1.88 J/cm2）較低，硬組織的表面溫升小于300℃，這可以解釋牙本質HA 晶體為何未發生變性和重建。有文獻報道，激光改性牙本質的變化主要包括碳酸鹽含量的降低和結晶度的提高，這可能會增加輻照底物對酸的耐受性［18］。He 等［19］同樣觀察到，當每單脈沖100 mJ 的Er:YAG 激光照射牙本質后，牙本質的耐酸性增加。本研究的結果與He 等先前報道的研究結果一致。

3 討論

牙本質由有機組分和無機組分組成，其中無機組分主要是HA 晶體中的鈣和磷。激光照射后生物組織的化學改變很大程度上取決于其成分的性質。SEM 結果表明，Er:YAG 激光組與球鉆組間鈣、磷含量及鈣磷比例無統計學差異，但磷酸處理同樣時間后，球鉆組鈣、磷含量顯著低于激光組，這說明激光組的牙本質表面變得更耐酸。Esteves-Oliveira 等［20］發現，Er:YAG 激光處理后牙本質碳磷比降低，表面變得更穩定、更耐酸。Ramos 等［21］發現Er:YAG 激光處理后牙本質膠原纖維變性融合，間隙縮小，這影響了磷酸接觸牙本質，阻礙了粘接劑滲透至脫礦全層，導致全酸蝕粘接組粘接強度低于自酸蝕組。

圖5 牙本質表面的SEM圖Fig. 5 SEM of treated dentin surfaces

表1 酸處理前后牙本質表面元素的平均值±標準差（原子百分比，at%）Tab. 1 ±s of dentin surface elements before and after acid treatment (atomic percentage, at%)

表1 酸處理前后牙本質表面元素的平均值±標準差（原子百分比，at%）Tab. 1 ±s of dentin surface elements before and after acid treatment (atomic percentage, at%)

注：不同小寫字母表示不同組間的結果具有統計學差異（P＜0.05）。Note: Different lowercase letters indicate significant differences in the results among different groups (P＜0.05).

Elements Sandpaper-treated group Er:YAG laser plus acid treated group Ca 19.22±2.91 a 20.01±2.90 a 18.97±2.96 a 7.07±1.30 b 7.58±1.18 b 14.67±1.93 c P 16.32±2.37 a 16.80±2.71 a 16.31±1.88 a 6.33±1.04 b 6.87±1.03 b 12.66±1.32 c Ca/P 1.20±0.11 a 1.19±0.11 a 1.18±0.11 a 1.12±0.08 a 1.11±0.06 a 1.16±0.10 a Bur-treated group Er:YAG laser-treated group Sandpaper plus acid treated group Bur plus acid treated group

軸向分辨率和成像深度是決定厚度測量準確性的關鍵參數。本研究所用的OCT 系統的軸向分辨率約為10 μm，對牙本質的成像深度超過250 μm，病理切片顯示深染層的厚度范圍是30～50 μm，因此本研究的OCT 系統可以準確測量Er:YAG 激光消融牙本質后表面變性層的厚度。OCT 結果顯示，所有試驗組牙本質表層光散射特性均發生改變，可見高亮層形成，光強度隨著深度的加深而減弱。定量結果表明，受Er:YAG 激光影響的牙本質層厚度明顯高于球鉆組和砂紙組，說明Er:YAG 激光導致的牙本質變性作用強于球鉆切削及砂紙拋光。OCT 圖像中不同的灰度值被認為是由于光從空氣傳到組織時折射率的差異造成的［13］。Er:YAG 激光的光熱機械消融作用可能使牙本質結構發生改變，從而導致OCT 圖像上不同厚度的改性層出現。組織學結果顯示，激光組牙本質表層有不規則邊界的連續嗜堿性薄變化層，而球鉆組未見牙本質表層或形成不連續的薄變化層，改性層結果與OCT 光強變化結果一致。同樣，Ishizaka 等［22］通過H&E 染色發現，激光處理的牙本質表面有一層嗜堿性深染層，而球鉆處理后牙本質表面未見深染層。與組織學相比，OCT 技術可實時無損地定量表征牙本質表層性狀的改變，兩種方法得到的改性層厚度有一定的相關性和一致性。

總之，本研究結果表明，使用OCT 技術可實時無損地定量表征牙本質表層性狀的改變，其效果相當于傳統的組織病理切片。經過一系列的數學轉換可得到牙本質修飾層的厚度。盡管激光處理后的牙本質的HA 晶體結構未發生改變，但激光處理后的牙本質變得更耐酸。從臨床的角度來看，這些信息將有助于牙醫確定粘接修復策略。在今后的研究中，應深入研究激光對牙齒表層的結構損傷及牙體硬組織性質的影響，以確定牙本質粘接修復的最佳方法。