HBV相關(guān)肝細胞肝癌微脈管癌栓局部免疫微環(huán)境對患者術(shù)后預(yù)后的影響

尹燦昆， 賽音賀西格， 郭欣欣， 高 峰， 侯英勇， 紀 元*

1. 復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院病理科，上海 200032 2. 復(fù)旦大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，上海 200433

原發(fā)性肝細胞肝癌(hepatocellular carcinoma，HCC)是目前全球范圍內(nèi)致死率排第4位的惡性腫瘤，患者預(yù)后受到流行病學(xué)分布、腫瘤組織病理分級和基因表達改變等多層次因素的共同影響。腫瘤微脈管侵犯(microvascular invasion，MVI)是指顯微鏡下可見微血管腔內(nèi)內(nèi)皮細胞襯覆的癌細胞巢團。MVI是降低患者生存預(yù)期重要的預(yù)后因素[1-4]。

在癌栓播散、轉(zhuǎn)移過程中，機體會釋放T、B淋巴細胞等多種免疫細胞協(xié)同抑制HCC生長，誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡，抑制腫瘤浸潤。但以PD-1為代表的免疫抑制性產(chǎn)物可抑制機體的抗腫瘤免疫能力，增加術(shù)后復(fù)發(fā)風(fēng)險。PD-1表達不局限于T細胞，還表達于B細胞、NK細胞以及一些腫瘤細胞。PD-1+T細胞常見于健康人體的循環(huán)系統(tǒng)，參與維持免疫穩(wěn)態(tài)，阻止自身免疫和過度的免疫反應(yīng)。然而，病理狀態(tài)下這種功能可被腫瘤細胞利用以進行免疫逃逸。因此PD-1是新型的腫瘤防治靶標[5-6]。近年來基于PD-1、PD-L1的免疫微環(huán)境靶向藥物研發(fā)及臨床應(yīng)用在HCC防治領(lǐng)域取得了顯著成效。

既往研究大多集中于MVI腫瘤細胞對HCC患者預(yù)后的影響，鮮有針對其所在局部免疫微環(huán)境對HCC患者預(yù)后影響的研究。針對MVI本身和免疫微環(huán)境的研究，或許可確定其是否可成為HCC獨立預(yù)后因素，并可進一步豐富其在HCC中的價值。因此，本研究使用HBV相關(guān)HCC病理數(shù)字切片，并量化數(shù)字切片中MVI免疫微環(huán)境中T、B淋巴細胞數(shù)及PD-1抗體表達，將量化數(shù)據(jù)引入預(yù)后分析，結(jié)合部分基本臨床指標，初步探討潛在的免疫病理學(xué)指標對HBV相關(guān)HCC預(yù)后的影響。

1 資料與方法

1.1 一般資料 本研究為回顧性隊列研究，樣本來自2012年3月至2013年11月于復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院初診的HCC患者。患者HCC組織學(xué)分化中且術(shù)前均無遠處轉(zhuǎn)移。收集性別、年齡、肝纖維化程度、腫瘤最大徑，巴塞羅那分期(Barcelona clinic liver cancer，BCLC)分期和甲胎蛋白(alpha fetoprotein，AFP)水平等指標。

納入標準：所有入選病例均有HBV感染史且無其他肝臟疾病基礎(chǔ)；術(shù)后未經(jīng)介入、放化療、射頻等其他治療方案；組織學(xué)分化中等且術(shù)前無遠處轉(zhuǎn)移。排除標準：隨訪結(jié)束后剔除非HCC致死和術(shù)后無復(fù)發(fā)時間不足2周的患者。納入病例均定期隨訪，終點事件為復(fù)發(fā)或死亡。末次隨訪為2018年11月30日。本研究經(jīng)復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院倫理委員會批準，所有患者均知情同意并簽署知情同意書。

1.2 HCC標本MVI的鑒別及癌栓局部微環(huán)境免疫狀態(tài)的觀察 調(diào)取入選患者術(shù)后病灶組織蠟塊，并復(fù)對已有H-E切片確定病灶有無MVI浸潤。對腫瘤保留完好的蠟塊按4 μm連續(xù)切片，行免疫組化染色，觀察CD3(LN10，Lecia)、CD4(4B12，Lecia)、CD8(Poly，Abcam)、CD20(L26，Dako)、PD-1(EPR4877，Abcam)表達水平。采用Aperio AT2400通量明場掃描儀(Lecia)掃描H-E和免疫組化玻片(最大放大倍數(shù)為200倍)，依據(jù)數(shù)字切片成片質(zhì)量，篩選出可用于免疫細胞計數(shù)的標本。

1.3 切片質(zhì)量分析及細胞表達量化 采用ImageJ定位數(shù)字切片中MVI，計數(shù)MVI中完整癌栓切面(in)及脈管外熱點處(ex)相同范圍的免疫細胞；對多個癌栓者，選最多3處肉眼可見的部位。計數(shù)后取平均值，計算CD4、CD8、PD-1、CD20表達量與CD3的比值。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 21.0軟件對MVI在內(nèi)的各類臨床資料進行Fisher檢驗。將多組差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)的數(shù)據(jù)納入多因素Cox風(fēng)險比例回歸模型，并進行似然比檢驗。剔除免疫細胞表達數(shù)據(jù)的極大及極小值后，使用受試者工作特征曲線(ROC)與約登指數(shù)篩選MVI樣本中具有潛在分析價值的免疫細胞標志物，并確定這些標志物在癌栓或其周圍肝組織的表達截斷值，按閾值進行分組。采用多因素Cox風(fēng)險比例回歸模型分析不同免疫細胞或其標志物表達情況對HCC患者預(yù)后影響。檢驗水準(α)為0.05。

2 結(jié) 果

2.1 MVI與HCC患者預(yù)后的相關(guān)性 納入175例HCC患者，死亡35例，復(fù)發(fā)88例。單因素分析結(jié)果(表1)表明：死亡患者與存活患者年齡和MVI發(fā)生率差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，表明年齡≤50歲和有MVI是患者死亡的預(yù)測因素。復(fù)發(fā)患者與無復(fù)發(fā)患者腫瘤最大徑和MVI發(fā)生率差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，表明HCC為塊狀型和有MVI均為HCC患者術(shù)后復(fù)發(fā)的重要預(yù)測因素。

表1 HBV相關(guān)HCC患者預(yù)后單因素分析 n

多因素分析結(jié)果(表2)及生存分析(圖1)表明：年齡和MVI不是患者死亡的獨立影響因素；腫瘤最大徑和MVI是患者術(shù)后復(fù)發(fā)的獨立影響因素(P<0.05)。

表2 影響患者預(yù)后的多因素Cox風(fēng)險比例回歸模型

圖1 患者術(shù)后OS與RFS的Kaplan-Meier生存曲線

2.2 癌栓局部免疫細胞數(shù)量對患者預(yù)后判斷截斷值的界定

2.2.1 陽性免疫細胞判斷 通過樣本質(zhì)控、復(fù)核和細胞計數(shù)，成功篩選出53例伴MVI患者(截至末次隨訪，15例死亡、31例復(fù)發(fā))的HCC樣本，對其腫瘤指標進行H-E染色及局部免疫細胞染色(圖2)。

圖2 伴MVI的HCC患者癌栓局部組織CD4和CD8的表達Original magnification: ×200

2.2.2 免疫細胞判斷預(yù)后的界值 結(jié)果(表3、圖3)表明：CD4+在MVI周圍肝表達密度(CD4ex)改變對HCC患者術(shù)后OS有潛在預(yù)測價值(P=0.086)，最佳截斷值為0.330；CD4+和CD8+細胞在瘤栓內(nèi)表達密度(CD4in和CD8in)對HCC患者術(shù)后RFS有預(yù)測價值(P<0.05)，而CD8+在MVI周圍肝臟的表達密度(CD8ex)對RFS有潛在預(yù)測價值(P=0.051)，最佳截斷值分別為0.208、0.465、0.655。

2.3 MVI癌栓局部不同CD4和CD8表達量對患者預(yù)后的影響 結(jié)果(表4)顯示：不同CD4ex表達組患者術(shù)后OS差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.012)，不同CD4in、CD8in和CD8ex表達組間RFS差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

表3 伴MVI的HCC患者癌栓局部免疫細胞ROC分析結(jié)果

圖3 MVI癌栓局部內(nèi)外CD4+、CD8+ T細胞對HCC患者術(shù)后OS及RFS影響的ROC曲線

表4 MVI免疫微環(huán)境中CD4和CD8細胞數(shù)量對患者預(yù)后影響

3 討 論

MVI是影響HCC預(yù)后的重要危險因素。Meniconi等[7]、Hirokawa等[8]研究表明，HCC首次術(shù)后對其組織病理切片中的MVI進行評估，對HCC復(fù)發(fā)和整體預(yù)后評判具有重要臨床意義，而探索MVI腫瘤組織及其微環(huán)境，特別是癌栓中及周圍免疫細胞表達，或有助于患者個體化治療方案的選擇。

本研究中相關(guān)因素分析結(jié)果表明，MVI可作為HCC術(shù)后復(fù)發(fā)的獨立預(yù)測因素，也可用于免疫微環(huán)境位點量化研究和患者生存分析。目前相關(guān)研究集中于HCC原發(fā)灶的免疫微環(huán)境表達譜，所需考慮的因素繁雜，而MVI的形態(tài)學(xué)診斷位點還有待深入研究。HCC原發(fā)灶T、B等免疫細胞數(shù)量增多是預(yù)后的積極因素。Kurebayashi等[9]通過對HCC腫瘤微環(huán)境中B/漿細胞、T細胞計數(shù)制定免疫分型標準，發(fā)現(xiàn)免疫細胞高度浸潤的HCC患者的預(yù)后更好；而且分化較差的HCC (CK19+和SALL4+)中若T、B細胞高度浸潤，則患者預(yù)后也較好。Lim等[10]發(fā)現(xiàn)，HBV相關(guān)HCC比非病毒相關(guān)HCC表達更多的PD-1，更易造成T細胞免疫耗竭。本研究發(fā)現(xiàn)，MVI癌栓內(nèi)以CD4+和CD8+T細胞為代表的獲得性免疫細胞數(shù)量與患者術(shù)后復(fù)發(fā)相關(guān)。Gabrielson等[11]與Garnelo等[12]得出相似結(jié)果。總之，量化分析HCC腫瘤原發(fā)灶免疫微環(huán)境、結(jié)合臨床數(shù)據(jù)，給予合并MVI的HCC患者MVI免疫病理診斷及個體化免疫治療，或可進一步減少HCC術(shù)后復(fù)發(fā)率，延長患者的生存期。

此外，本研究中PD-1表達量會隨T細胞增多而增加，但MVI瘤栓和周圍肝臟的PD-1均無預(yù)測預(yù)后的價值。由于PD-1并非唯一引發(fā)腫瘤免疫耐受的因素，且其功能多樣[13-15]，故針對以PD-1為代表的多種腫瘤免疫抑制因子的多因素研究將是下一步MVI免疫微環(huán)境量化分析的側(cè)重點。此外，因本研究中PD-L1表達水平很低，無法獲取癌栓中的PD-L1表達量化數(shù)據(jù)，故未來可能更換新的腫瘤免疫抑制標志物。利用ImageJ對數(shù)字切片進行整體觀察、多點定位和細微觀測，是一種高效便捷的方案。本研究表明，HBV相關(guān)HCC原發(fā)灶CD4+/CD8+T細胞增多可抑制HCC復(fù)發(fā)、延長RFS，并證明上述方案在HBV相關(guān)HCC研究中可行。將來會納入更多的HCC患者，同時探索可用于免疫病理學(xué)診斷的更多數(shù)據(jù)，以期為融合免疫微環(huán)境指標的HCC診斷標準提供參考。

綜上所述，本研究結(jié)果表明，HBV相關(guān)HCC微脈管癌栓內(nèi)CD4+T細胞和CD8+T細胞浸潤量增加可能與患者首次術(shù)后復(fù)發(fā)率降低、RFS延長有關(guān)。