Ang-1 基因轉染至BMSCs 后對高氧誘導的新生鼠視神經損傷模型的協同保護作用

陳遷 任建兵 黎紅平 王柱 任竹瀟 甘嘉敏 向建文 聶川

BMSCs 是骨髓中一種具有多向分化能力的干細胞,是骨髓造血微環境的關鍵組分,其在體外環境中的增殖能力很強,而免疫應答的性能較弱,可以保持原代細胞的遺傳穩定,尤其是在組織受損的情況下,采用BMSCs 治療可以修復受損的組織,同時在受損的組織旁分泌血管生成因子、營養因子,以改善血管生成的微環境,促進血管新生［1-3］。Ang-1 以存在血管內皮細胞中為主,在血管生成素受體酪氨酸激酶2(Tie-2)受體的誘導下可以促進血管生成和組織修復等［4,5］。其在缺血和缺氧的環境中具有較強的耐受性,是促血管生成素的一種類型,可以促進血管成熟,誘導血管內皮細胞趨化,抑制血管內皮細胞凋亡等［6］。本研究通過高氧誘導視神經損傷小鼠,給小鼠注射Ang-1 基因轉染至BMSCs,觀察Ang-1 基因轉染至BMSCs 后對高氧誘導的新生鼠視神經損傷模型的協同保護作用報告如下。

1 材料與方法

1.1 材料 選擇30 只出生后3 d 的健康小鼠,母鼠同籠,均購自常州卡文斯實驗動物有限公司。幼鼠體重5～20 g,置于安靜、室溫和濕度適宜的環境下進行飼養。造模期間可自由攝食和飲水。將30 只小鼠隨機分為高氧鹽水組、空白對照組、Ang-1 基因轉染至BMSCs 后注射高氧鹽水組(Ang-1+BMSCs 高氧組),每組10 只。

1.2 方法 高氧鹽水組和Ang-1+BMSCs 高氧組小鼠在高濃度氧環境下共飼養5 d,嚴密關注是否有死亡的小鼠。待鼠齡12 d 將上述兩組小鼠移至空氣中,與空白對照組一同飼養直至鼠齡17 d,觀察三組小鼠的一般情況、活動能力、體重。其中Ang-1+BMSCs 高氧組在鼠齡第6 天、第10 天、第14 天分別于顯微鏡下向玻璃體內注射轉染Ang-1 基因的BMSCs 細胞(0.1 ml/只),內含細胞數平均為 1×106/0.1 ml,空白對照組和高氧鹽水組在鼠齡第6 天、第10 天、第14 天分別注射同等劑量的9%氯化鈉溶液。

從液氮儲罐中取出BMSCs 菌株,將其置于37.0℃的溫水中。緩慢搖晃裝有BMSC 的橡膠手套,直到BMSC 逐漸融化為液體。然后將裝有BMSC 的冷凍管放在測試臺上,通風,將BMSCs 懸浮液轉移至離心管中,加入細胞培養基,緩慢吸移使其完全混合,1000 r/min,離心5 min；用移液管棄去上清液,加入含血清的培養基,用移液管吸移,在顯微鏡下觀察細胞形態。細胞復蘇后,將復蘇的細胞接種到培養瓶中,觀察1 d 后細胞融合程度,更換細胞培養基,在顯微鏡下觀察細胞狀態。細胞貼壁超過80%時,進行亞培養；去除舊培養基,添加PBS 緩沖液沖洗培養瓶,棄去PBS 緩沖液,沖洗3 次,用胰蛋白酶消化,搖動培養瓶,讓胰酶充分接觸細胞,將其置于37.0℃的培養箱中,并進行培養,當其處于絮凝狀態,細胞會縮回,則培養完成。該過程在超凈工作臺上進行；在顯微鏡下觀察貼壁細胞的縮回狀態。細胞和細胞之間的空間變大,并且細胞呈球狀,當少量細胞脫離壁時,應立即終止消化。用移液器輕輕吹動瓶壁,使細胞與瓶壁分離,形成單細胞懸液。在顯微鏡下觀察瓶壁,細胞幾乎完全脫落后,將細胞懸液轉移至離心管中,1000 r/min,離心5 min,除去上清液,加入適量的培養基,用玻璃移液管吹動細胞,在顯微鏡下觀察并記錄細胞數量。以1∶2 的速率亞培養細胞數,觀察培養基的顏色,并根據細胞的粘附性每天更換一次培養基；每天在顯微鏡下觀察并記錄亞培養的情況。

觀察每組小鼠的發育情況,在18 d 時從每組小鼠中獲取視神經組織,行蘇木精-伊紅染色法(HE)和固藍染色(FASTBLUE,LFB)、免疫熒光檢測、免疫組化染色及透射電子顯微鏡觀察。

1.3 觀察指標 比較三組小鼠有髓神經纖維數目、直徑、軸索直徑及髓鞘厚度。

1.4 統計學方法 采用SPSS22.0 統計學軟件對研究數據進行統計分析。計量資料以均數±標準差()表示,三組比較采用方差檢驗。P<0.05 表示差異具有統計學意義。

2 結果

空白對照組、Ang-1+BMSCs 高氧組軸索直徑顯著長于高氧鹽水組,差異具有統計學意義(P<0.05)；三組軸索直徑比較差異具有統計學意義(P<0.05)。空白對照組、Ang-1+BMSCs 高氧組有髓神經纖維直徑長于高氧鹽水組,差異具有統計學意義(P<0.05)；三組有髓神經纖維直徑比較差異具有統計學意義(P<0.05)。高氧鹽水組、Ang-1+BMSCs 高氧組有髓神經纖維數目低于空白對照組,Ang-1+BMSCs 高氧組神經纖維數量明顯高于高氧鹽水組,差異具有統計學意義(P<0.05)；三組有髓神經纖維數量比較差異具有統計學意義(P<0.05)。空白對照組、Ang-1+BMSCs 高氧組髓鞘厚度大于高氧鹽水組,差異具有統計學意義(P<0.05)；三組髓鞘厚度比較差異具有統計學意義(P<0.05)。見表1。

表1 三組小鼠有髓神經纖維數目、直徑、軸索直徑及髓鞘厚度比較()

表1 三組小鼠有髓神經纖維數目、直徑、軸索直徑及髓鞘厚度比較()

注：三組比較,P<0.05

3 討論

用透射電鏡觀察各組的視神經,高氧鹽水組視神經纖維的髓鞘清晰可見,軸索與髓鞘之間有縫隙,可見髓鞘板層狀分離,軸索水腫,線粒體腫脹,軸索中的微絲溶解,微管丟失,并形成液泡。有髓神經纖維的直徑和數量減小,而無髓神經纖維的數量增多。空白對照組,高氧鹽水組和Ang-1+BMSCs 高氧組分別進行形態學定量分析,空白對照組和Ang-1+BMSCs 高氧組的有髓神經纖維直徑和軸索直徑長于高氧鹽水組,Ang-1+BMSCs 高氧組、空白對照組有髓神經纖維數目和髓鞘厚度明顯大于高氧鹽水組,差異具有統計學意義(P<0.05),這表明Ang-1 基因轉染BMSCs 可幫助恢復高氧誘導所致視神經損傷的超微結構。本研究將Ang-1基因轉染至 BMSCs 中,觀察Ang-1 基因和BMSCs 對高氧誘導所致視神經損傷的協同保護作用,研究結果表明,Ang-1 基因轉染BMSCs 可能對高氧誘導新生小鼠的視神經損傷有一定的保護作用,表明干細胞治療是一種具有發展前景的視神經損傷治療方式。

高氧誘導的新生小鼠視神經損傷會自發性退縮,因此不可能進行長期研究,并且,Ang-1 能否保持長效,各研究者存在意見分歧,此外,Ang-1 的用藥方法、用藥劑量以及使用后是否會對角膜、晶狀體等產生毒副反應仍不確定,需進行深入的研究以證實［6］。本研究選取的BMSCs 免疫應答性能較弱,其分化能力相比胚胎干細胞較弱,同時我國對于干細胞研究缺少相應的法律制度,導致當前關于干細胞的研究監管力度不大,科學性和合理性較低,僅停留于動物階段。當前我國出現的研究大多是關于BMSCs 對視神經的保護作用,很多研究仍在持續進行,并且部分實驗已經完成,大部分研究是關于視網膜神經節和軸突生長方面的研究［7］。另外,以后的研究可能需對視覺功能進行分析以探討干細胞的作用機制,對于制定安全性和有效性均較高的治療方法意義重大。不可否認的是,這是一個艱巨而持久的任務,并且需在顯微領域以及免疫領域都獲得進步。

綜上所述,高氧誘導新生鼠視神經損傷后將Ang-1 基因轉染到BMSCs 中可以明顯改善受損視神經的超微結構。但是,視神經損傷的長期作用及其機制尚需深入研究。