Seipin變化對6-OHDA誘導的PC12帕金森細胞模型自噬及凋亡的影響*

胡玉梅，郭冬芬，任真奎，劉穎，吳昌學 **，禹文峰,3**

(1.貴州醫科大學 分子生物學重點實驗室, 貴州 貴陽 550004; 2.貴州醫科大學 地方病與少數民族疾病教育部重點實驗室, 貴州 貴陽 550004; 3.貴州醫科大學 基礎醫學院, 貴州 貴陽 550004)

帕金森病(parkinson disease，PD)是一種較常見的神經系統變性疾病[1]。研究認為，PD病理特征主要是由于黑質黑色素神經元變性丟失、多巴胺能神經元內的α-突觸核蛋白(α-synuclein, α-syn)的異常積累、路易小體的出現以及遺傳等因素，其臨床表現包括運動遲緩、靜止性震顫及肌強直等運動癥狀，長期服用藥物治療后出現療效降低及多種不良反應，如癥狀波動和異動癥等，且無法根治[2-4]。有研究者從深部腦刺激、基因層面、細胞移植及神經營養因子等方面研究，探索對PD的治療方式[5]。隨著生物信息學的發展，基因在疾病中的研究越來越多，基因可通過多種方式調節控制蛋白的表達、修飾等從而調控疾病的形成[6-7]。Seipin是由人類先天性全身性脂肪營養不良Ⅱ型基因(berardinelli-seip congenital lipodystrophy type 2 , BSCL2/Seipin)編碼的蛋白，與人類多種疾病的發生機制尚不清楚[8-10]。近年來，Seipin的研究部分轉向神經疾病，Seipin能通過過氧化物酶體增殖物激活受體γ(PPARγ)調節控制糖原合成激酶3β(GSK3β)從而影響神經元的生長，使神經元變性丟失；Seipin缺失后使大鼠神經元的增殖減慢、神經元減少，誘發疾病的發生[11-12]。由于Seipin在大腦中高表達，當其缺失后會引起相關功能的紊亂，引發一系列疾病[13-15]。在神經退行性疾病中，神經細胞受到外在條件脅迫發生損傷、凋亡時，引起細胞內凋亡相關蛋白Bax、Clevedcaspase-3的增加，使細胞發生非程序性死亡[16-17]；同時細胞自身會產生一系列調節反應，其中包括有細胞自噬(autophagy)這一過程[18]。細胞自噬能將一些受損蛋白或線粒體降解從而減少細胞凋亡，降低細胞的損傷程度而維持細胞內穩態[19-20]。在PD患者中也會存在一些損壞的蛋白或細胞器，自噬過程還未完全闡明，本研究利用6-羥基多巴胺氫溴酸鹽(6-Hydroxydopamine hydro, 6-OHDA)刺激腎上腺嗜鉻細胞瘤(pheochromocytoma, PC12)細胞構建PD細胞模型[21-22]，觀察Seipin的表達變化，探討Seipin與自噬和細胞凋亡的關系。

1 材料方法

1.1 材料

1.1.1細胞株 PC12細胞購買于上海生命科學院細胞庫。

1.1.2試劑 6-OHDA(美國sigam公司)，BCA定量試劑盒(美國Thermo fish公司)，一抗二抗稀釋液(上海碧云天生物技術有限公司)，β-actin(美國CST公司)、Seipin(美國abcom)，Bax(美國CST公司)，Bcl-2(美國CST公司)，Clevedcaspase-3(美國CST公司)，p-mTOR(美國CST公司)，LC3Ⅱ/Ⅰ(美國CST公司)，Beclin1(美國CST公司)。

1.2 方法

1.2.1細胞分組 正常的PC12細胞株分為正常組、加藥組；Seipin敲低及其對照組的PC12細胞分為Seipin敲低對照組(KD-control)、Seipin敲低組(KD)、Seipin敲低對照加藥組(KD-control+6-OHDA)、Seipin敲低加藥組(KD+6-OHDA)；Seipin過表達及其對照組的PC12細胞分為Seipin過表達對照組(OE-control)、Seipin過表達組(OE)、Seipin過表達對照加藥組(OE-control+6-OHDA)、Seipin過表達加藥組(OE+6-OHDA)，上述敲低及過表達Seipin的PC12細胞株前期已驗證。

1.2.2細胞加藥處理 取出培養瓶，棄培養液，PBS洗3遍、每次5 min，加入0.25%胰酶0.3 mL消化細胞1 min；加入含10% FBS 2 mL培養基終止消化，1 000 r/min離心5 min，棄上清；培養基重懸混勻后計數，以1.0×105個/mL種入6孔板中培養，培養至細胞鋪滿瓶底70%～80%時更換成含6-OHDA濃度為75 μmoL的DMEM培養，18 h后做相關檢測。

1.2.3Western blot 為檢測自噬通路蛋白mTOR和p-mTOR，自噬相關蛋白LC3、Beclin1，凋亡相關蛋白Bax、Bcl-2、Cleved-caspase-3和Seipin蛋白的變化，將6-OHDA處理好的6孔板取出，去除培養液，PBS洗3次，加入細胞裂解液，轉移至1.5 mL Epp管冰上裂解30 min、間隔5 min震蕩1次，4 ℃ 12 000 r/min 離心20 min；吸取上清入新的1.5 mL離心管，BCA蛋白定量試劑盒分析蛋白濃度，吸取上清加入SDS蛋白上樣緩沖液，沸水浴10 min；取出放入冰上，按每孔30 μg等量上樣。40 mA SDS-PAGE凝膠電泳，240 mA冰浴轉膜2 h；取出1×TBST洗3遍，封閉1 h，1×TBST洗3遍；放入孵育盒加入一抗 4 ℃搖床孵育過夜后，1×TBST洗3遍、每次5 min，加入二抗(1 ∶4 000)室溫孵育2 h，1×TBST洗3遍、每次5 min；化學發光儀曝光。

1.3 統計學分析

2 結果

2.1 帕金森細胞模型中凋亡、自噬相關蛋白及Seipin表達

2.1.1凋亡相關蛋白 Western blot檢測凋亡相關蛋白Bcl-2、Bax、Cleved-caspase-3表達情況，結果顯示加藥組相對正常組Bax/Bcl-2、Cleved-caspase-3升高，P<0.01，見圖1。

注：(1)與正常組比較，P<0.01。

2.1.2自噬相關蛋白表達 Western blot檢測mTOR、p-mTOR及自噬相關蛋白Beclin1、LC3表達情況，加藥組相對正常組p-mTOR降低，自噬相關蛋白Beclin1、LC3增加(P<0.01)。見圖2。

注：(1)與正常組比較，P<0.01。

2.1.3Seipin表達 Western blot檢測Seipin表達情況，當加入6-OHDA后Seipin表達量相對正常組降低，P<0.01，見圖3。

注：A為Western blot檢測圖，B為Seipin蛋白統計圖；(1)與正常組比較，P<0.01。

2.2 Seipin敲低對帕金森細胞模型自噬和凋亡的影響

2.2.1對自噬的影響 Western blot結果顯示，KD與KD-control比，p-mTOR/mTOR升高、自噬相關蛋白降低，分別加入6-OHDA處理后自噬都增強，但KD+6-OHDA自噬相關蛋白表達量低于KD-control+6-OHDA，P<0.05，見圖4。

注：(1)與KD-control比較，P<0.05；(2)與KD-control+6-OHDA比較，P<0.05。

2.2.2對凋亡的影響 Western blot結果顯示，加入6-OHDA處理后凋亡相關蛋白都增強，但KD+6-OHDA凋亡相關蛋白表達量高于KD-control+6-OHDA，P<0.05，見圖5。

注：(1)與KD-control比較，P<0.05；(2)與KD-control+6-OHDA比較，P<0.05。

2.3 Seipin過表達對帕金森細胞模型自噬和凋亡的影響

2.3.1對自噬的影響 Western blot結果顯示，OE相對OE-control比，p-mTOR/mTOR降低、自噬相關蛋白升高，分別加入6-OHDA處理后自噬都增強，但OE+6-OHDA自噬相關蛋白表達量高于OE-control+6-OHDA，P<0.05，見圖6。

注：(1)與OE-control比較，P<0.05；(2)與OE-control+6-OHDA比較，P<0.05。

2.3.2對凋亡的影響 Western blot結果顯示，加入6-OHDA處理后凋亡相關蛋白增強，但OE+6-OHDA凋亡相關蛋白表達量低于OE-control+6-OHDA，P<0.05，見圖7。

注：(1)與OE-control比較，P<0.05；(2)與OE-control+6-OHDA比較，P<0.05。

3 討論

帕金森是困擾許多中老年人的一種神經退行性疾病，目前主要是預防和減緩，不能完全治愈[3]。研究發現PD患者黑質含黑色素細胞數目減少，出現Lewy小體，多巴胺能神經元變性丟失，但其發病機制還未完全闡明[4]。6-OHDA具有神經毒性，常用6-OHDA誘導PC12細胞，構建PD的細胞模型進行PD研究[21-22]。采用6-OHDA刺激PC12細胞，加藥組Seipin含量相對正常組明顯降低；凋亡相關蛋白Bax/Bcl-2、Cleved-caspase-3增多差異有統計學意義(P<0.05)。p-mTOR/mTOR降低，自噬相關蛋白Beclin1、LC3Ⅱ/Ⅰ增加。可能是加入6-OHDA后細胞受損，凋亡蛋白增加，細胞自身代償反應使自噬增強，以排除受損蛋白或細胞器。Seipin是先天性脂肪營養不良二型基因編碼的蛋白，定位于內質網，具有調節脂滴的形成、脂肪生成影響神經疾病的作用，在大腦中高表達，Seipin除調節脂滴、脂肪組織的形成外可能對大腦有重要作用[9]。在用具有神經毒性的6-OHDA刺激PC12細胞后，加藥組中凋亡增強、細胞自噬水平升高、Seipin含量降低，可能是由于加入6-OHDA后細胞受損，凋亡蛋白增加，而細胞自身代償反應使自噬增強，排除受損蛋白或細胞器，同時Seipin下降，于是我們通過將Seipin敲低和過表達，并加入6-OHDA觀察Seipin的變化及自噬和細胞凋亡的情況。發現Seipin敲低后自噬降低，Seipin過表達后自噬增加；加藥后Seipin敲低加藥組比Seipin敲低對照加藥組自噬低，凋亡蛋白多；Seipin過表達加藥組相對Seipin過表達對照加藥組自噬高，凋亡蛋白減少。6-OHDA可能通過降低Seipin調節的自噬，誘導細胞發生凋亡。Seipin功能廣泛，在神經疾病中可能有重要作用，但具體機制及影響需要更多研究者去研究發現。