槲皮素通過調(diào)控高爾基應(yīng)激對(duì)脂多糖誘導(dǎo)小鼠副鼻竇炎的影響機(jī)制*

盧志賓，王旭燕，田素景，朱建光，白云冬，高躍

(陸軍第82集團(tuán)軍醫(yī)院 眼耳鼻喉科，河北 保定 071000)

副鼻竇炎亦稱鼻竇炎，是目前耳鼻咽喉科中常見的一種多發(fā)病，亦是鼻咽癌患者經(jīng)過放療后出現(xiàn)的一種較為常見的并發(fā)癥[1-3]。副鼻竇炎是由多種因素共同作用引起的疾病，其中細(xì)菌感染是公認(rèn)的一項(xiàng)重要病因[4-6]，主要有革蘭陰性菌和陽性菌的混合共存[7-9]。脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)是革蘭陰性菌的細(xì)胞壁成分，是導(dǎo)致發(fā)病的關(guān)鍵因子。LPS可與跨膜受體toll樣受體4(toll-like receptor 4，TLR4)結(jié)合，進(jìn)而將外源信號(hào)傳至細(xì)胞內(nèi)。LPS在免疫系統(tǒng)中具有雙重的影響，一方面LPS能促進(jìn)機(jī)體整體或局部的免疫系統(tǒng)抵制細(xì)菌感染；而當(dāng)感染嚴(yán)重時(shí)，大量的LPS與機(jī)體單核巨噬細(xì)胞作用，產(chǎn)生大量炎癥因子致使炎癥反應(yīng)失控，出現(xiàn)感染性休克或器官衰竭的現(xiàn)象[9]。槲皮素是黃酮類化合物中較為典型的一種，具有顯著的抗氧化性強(qiáng)的特點(diǎn)，屬于分布范圍最廣、也是人類飲食中含量最多的一種生物類黃酮[10]。槲皮素具有抗菌消炎、抗腫瘤、保肝護(hù)肝等功效，具有較強(qiáng)的針對(duì)革蘭陰性菌的抗菌效果，可用于預(yù)防各種細(xì)菌性感染類的疾病[11-12]。為了探究鼻竇炎的治療方法，本研究通過研究槲皮素對(duì)LPS誘導(dǎo)的小鼠副鼻竇炎的影響，進(jìn)而探究槲皮素改善小鼠副鼻竇炎的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 選取30只清潔級(jí)昆明小鼠，雄性，體質(zhì)量(20±2)g，無鼻腔或上呼吸道疾病，購自復(fù)旦大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室。

1.1.2試劑和儀器 氯胺酮(江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司，國藥準(zhǔn)字S20060104)，LPS(湖南一格制藥有限公司，國藥準(zhǔn)字S43020003)，槲皮素(中國藥品生物制品檢定所，批號(hào)100081-200406)。超凈臺(tái)(BIOBASE博科超凈臺(tái))，4%多聚甲醛(上海碧云天公司)，HE染色法試劑盒(上海碧云天公司)，光鏡顯微鏡(徠卡顯微系統(tǒng)，德國Leica公司)。大鼠抗小鼠高爾基體蛋白GM130單克隆抗體(美國Sigma公司)，大鼠抗小鼠高爾基體蛋白GOLPH3單克隆抗體(美國Sigma公司)，大鼠抗小鼠半胱氨酸蛋白酶單克隆抗體(美國Sigma公司)。組織蛋白裂解液(上海碧云天公司)，BCA法試劑盒(上海碧云天公司)，雙向電泳2-DE系統(tǒng)(北京六一生物科技有限公司)，PVDF膜(美國Sigma公司)，腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)ELISA試劑盒(上海碧云天公司)及白介素-6(interleukin-6，IL-6)ELISA試劑盒(上海碧云天公司)。

1.2 方法

1.2.1實(shí)驗(yàn)分組與建模 將45只小鼠隨機(jī)均分為正常組、模型組和治療組，模型組和治療組小鼠構(gòu)建副鼻竇炎模型，通過肌肉注射150 mg/kg的氯胺酮使其麻醉，使用1 mL注射器吸取1 mg/L的LPS 0.1 mL，通過鼻腔滴入法將LPS滴入小鼠鼻腔內(nèi)；對(duì)照組滴生理鹽水。造模后治療組每天通過灌胃法給予100 mg/kg的槲皮素，對(duì)照組和模型組給予生理鹽水。

1.2.2鼻竇黏膜組織的病理學(xué)檢測(cè) 造模兩周后，斷頭處死法處死小鼠，取出小鼠鼻黏膜組織，置于4%多聚甲醛中固定，鼻竇黏膜進(jìn)行HE切片制作。光鏡下觀察實(shí)驗(yàn)小鼠的鼻黏膜改變，進(jìn)行鼻黏膜組織病理評(píng)分評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)：A黏膜上皮(0～3分)、B增生(0～3分)、C腺體增生(0～3分)、D炎性浸潤(rùn)(0～3分)、E 變性壞死(0～3分)、F 淋巴樣組織增生、鼻黏膜組織病理指數(shù)=B+3(A+D)+C+E+F，評(píng)分越高、病理改變?cè)街亍?/p>

1.2.3免疫印跡(Western blot)法檢測(cè)高爾基體蛋白GM130、高爾基體蛋白GOLPH3和半胱氨酸蛋白酶(cysteine protease，Caspase3)表達(dá) 小鼠鼻竇黏膜組織研磨成粉末狀后，加組織蛋白裂解液處理30min，獲取組織蛋白，BCA法檢測(cè)蛋白含量；電泳、轉(zhuǎn)膜，大鼠抗小鼠高爾基體蛋白GM130單克隆抗體、大鼠抗小鼠高爾基體蛋白GOLPH3單克隆抗體、大鼠抗小鼠半胱氨酸蛋白酶單克隆抗體孵育，漂洗和顯影，測(cè)定高爾基體蛋白GM130、GOLPH3和Caspase3表達(dá)。

1.2.4酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(ELISA)法檢測(cè)TNF-α和IL-6含量 小鼠鼻黏膜組織，研磨成粉末狀后，按照TNF-α和IL-6 ELISA試劑盒說明書測(cè)定TNF-α和IL-6含量。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 一般狀態(tài)

實(shí)驗(yàn)各組小鼠在造模前均可正常飲食、飲水、活動(dòng)自如，精神狀態(tài)良好，毛發(fā)光澤、無掉毛或脫毛、無鼻涕、無噴嚏等癥狀。造模后，正常組小鼠一般情況與造模前相似；模型組小鼠出現(xiàn)流涕、撓鼻、打噴嚏等現(xiàn)象，1周后達(dá)到高峰；治療組造模后出現(xiàn)撓鼻、流涕的現(xiàn)象，但抓鼻、撓鼻和流涕的現(xiàn)象較模型組少。

2.2 病理學(xué)改變

正常組小鼠的鼻腔和鼻竇黏膜組織的結(jié)構(gòu)規(guī)則，無明顯的炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，僅含有少量杯狀細(xì)胞；而模型組和治療組小鼠鼻竇黏膜下層有纖維組織增生、漿細(xì)胞浸潤(rùn)、上皮細(xì)胞脫落、壞死，上皮細(xì)胞分布不均等現(xiàn)象；且模型組較治療組的現(xiàn)象更嚴(yán)重(圖1)。

注：A為鼻竇黏膜組織，B為鼻腔黏膜組織。

2.3 病理指數(shù)評(píng)分

與正常組比較，模型組小鼠鼻竇黏膜的病理指數(shù)評(píng)分升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與模型組比較，治療組小鼠鼻竇黏膜的病理指數(shù)評(píng)分降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表1。

表1 各組小鼠鼻竇黏膜病理指數(shù)評(píng)分

2.4 GM130、GOLPH3和Caspase3表達(dá)

與正常組比較，模型組小鼠鼻黏膜組織中GOLPH3和Caspase3表達(dá)增加，GM130蛋白表達(dá)減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與模型組比較，治療組GOLPH3和Caspase3表達(dá)減少，GM130表達(dá)增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見圖2和表2。

圖2 各組小鼠高爾基體蛋白GM130、GOLPH3和Caspase3的表達(dá)

表2 各組小鼠鼻竇黏膜高爾基體蛋白GM130、GOLPH3和Caspase3的表達(dá)

2.5 TNF-α、IL-6

與正常組比較，治療組小鼠鼻竇黏膜組織內(nèi)炎性因子TNF-α和IL-6含量相對(duì)升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與模型組比較，治療組小鼠鼻竇黏膜組織內(nèi)炎性因子TNF-α和IL-6含量相對(duì)減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表3。

表3 槲皮素對(duì)鼻竇炎小鼠鼻竇黏膜TNF-α和IL-6含量的影響

3 討論

鼻竇炎是宿主和其周圍環(huán)境因素等相互作用的結(jié)果，每年因鼻竇炎治療的費(fèi)用接近60億美元，給患者的家庭也帶來了沉重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)[13]。隨著鼻內(nèi)鏡外科技術(shù)的不斷發(fā)展，鼻竇炎治療困境得到了一定緩解作用，但仍存在術(shù)后復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移等現(xiàn)象。本研究發(fā)現(xiàn)，采用LPS誘導(dǎo)形成的副鼻竇炎小鼠模型經(jīng)過槲皮素治療后，其病理形態(tài)學(xué)較模型組較為接近正常健康小鼠，病理指數(shù)評(píng)分較低，且小鼠的鼻黏膜內(nèi)高爾基蛋白GOLPH3和Caspase3表達(dá)減少，而GM130蛋白表達(dá)增加，同時(shí)炎癥因子TNF-α和IL-6含量減少。高爾基體屬于一個(gè)動(dòng)態(tài)結(jié)構(gòu)，可不斷的與其他細(xì)胞器進(jìn)行脂質(zhì)和蛋白質(zhì)的交流[14]。GOLPH3屬于高爾基體來源的一種應(yīng)激相關(guān)蛋白，主要位于高爾基體的外膜處，該蛋白的表達(dá)水平和機(jī)體細(xì)胞內(nèi)的氧化應(yīng)激水平之間存在著正相關(guān)[15]。該基因是對(duì)于高爾基體的結(jié)構(gòu)及其順行轉(zhuǎn)運(yùn)等方面存在著重要影響。GM130屬于高爾基體中一種順式基質(zhì)蛋白，可用于維持帶狀形態(tài)特征結(jié)構(gòu)。當(dāng)GM130磷酸化后便與P115結(jié)合能力降低，是造成高爾基復(fù)合物裂解的主要原因之一。在對(duì)糖尿病性心肌病的研究中發(fā)現(xiàn)，外源性精胺能夠通過降低GM130表達(dá)，增加caspase 3和GOLPH 3表達(dá)，用于抑制高爾基體應(yīng)激，達(dá)到減輕高糖誘導(dǎo)的小鼠心肌損傷的效果。因此，GOLPH3和GM130是高爾基應(yīng)激反應(yīng)中重要的參與者[16]。

上呼吸道炎癥性疾病的發(fā)病因素較為復(fù)雜，其發(fā)病過程中具有多種炎性細(xì)胞、免疫細(xì)胞和細(xì)胞因子的參與[17]。Dellacono等[18]研究發(fā)現(xiàn)，在慢性炎癥鼻黏膜組織中具有白介素-4(interleukin-4，IL-4)和干擾素γ(interferon-γ，IFN-γ)的表達(dá)，且該兩種因子比例和患者鼻黏膜內(nèi)Th2/Th1炎癥反應(yīng)類型存在相關(guān)性。在用LPS刺激細(xì)胞6 h后發(fā)現(xiàn)，0～100 mg/L的LPS可刺激IFN-γ分泌增加，當(dāng)其在0～20 mg/L時(shí)，可刺激IL-4分泌增加[19]。因此認(rèn)為高濃度的LPS刺激可導(dǎo)致毒性損傷增強(qiáng)。在對(duì)慢性鼻竇炎患者的研究中發(fā)現(xiàn)，當(dāng)長(zhǎng)期給予患者低劑量的大環(huán)內(nèi)酯類藥物進(jìn)行治療時(shí)，其治療效果良好，可有效降低機(jī)體內(nèi)炎癥因子水平[20]。在早期的鼻竇炎發(fā)病因素的研究中，臨床上大部分主張用抗生素作為治療鼻竇炎的主要藥物，證實(shí)炎性反應(yīng)和鼻竇炎之間具有相關(guān)性。

槲皮素被認(rèn)為是一種常見的黃酮醇類物質(zhì)，當(dāng)其被人體消化吸收后，形成結(jié)合型物質(zhì)，主要以硫酸化、甲基化和葡萄糖磷酸化的形式存在[21]。在對(duì)槲皮素和其代謝物的研究中發(fā)現(xiàn)，生理濃度為2 μmol/L和10 μmol/L的槲皮素可有效抑制機(jī)體內(nèi)細(xì)胞間黏附分子-1(intercellular cell adhesion molecule-1，VCAM-1)和細(xì)胞間黏附分子-1(intercellular cell adhesion molecule-1，ICAM-1)及單核細(xì)胞趨化蛋白1(monocyte chemotactic protein 1，MCP-1)趨化因子的表達(dá)，其中槲皮素的主代謝物對(duì)這些炎癥因子的抑制作用低于槲皮素[22]。有研究認(rèn)為，槲皮素對(duì)人中性粒細(xì)胞無明顯的保護(hù)作用。但在LPS誘導(dǎo)小鼠PAW264.7巨噬細(xì)胞的研究中發(fā)現(xiàn)，槲皮素可有效抑制由LPS刺激引起的IL-1、TNF-α和IL-6等因子的轉(zhuǎn)錄和蛋白的合成[23]。槲皮素代謝物對(duì)于內(nèi)皮細(xì)胞具有有效的保護(hù)作用。槲皮素作為一種抗菌因子可有效降低機(jī)體內(nèi)的炎癥反應(yīng)，減少炎性因子的分泌[24]。中藥中所含的槲皮素對(duì)革蘭陰性菌的抑菌功效比革蘭陽性菌強(qiáng)，其中表現(xiàn)在對(duì)3種真菌的強(qiáng)抑制性。因此，槲皮素作為廣譜類的抗菌物質(zhì)，可用于治療細(xì)菌感染性疾病。槲皮素對(duì)于LPS引發(fā)的機(jī)體炎癥反應(yīng)和免疫應(yīng)答具有顯著抑制作用。槲皮素的作用機(jī)制可能通過核因子KB(nuclear factor-kB，NF-kB)活化后，抑制細(xì)胞內(nèi)ICAM-1因子的表達(dá)達(dá)到治療作用。LPS刺激后，經(jīng)槲皮素治療可有效抑制其黏附分子CD11b/CD18和CD62L的表達(dá)，降低LPS誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)的活化效應(yīng)，從而減少炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)。

綜上所述，槲皮素可通過調(diào)節(jié)高爾基應(yīng)激抑制由LPS誘導(dǎo)的小鼠鼻竇炎的炎癥反應(yīng)，達(dá)到改善小鼠鼻竇炎癥狀的作用。