靶向阻斷CXCR4對上皮性卵巢癌細胞CD44和CD133表達的影響*

陳永香，楊夢月，彭仁國，曹言言，訾聃

(1.貴州醫科大學 臨床醫學院，貴州 貴陽 550025；2.貴州醫科大學附屬醫院 婦產科，貴州 貴陽 550004; 3.貴州醫科大學 組織工程與干細胞實驗中心，貴州 貴陽 550025)

上皮性卵巢癌是常見的婦科腫瘤，全球每年有12.5萬患者死于卵巢癌，嚴重威脅女性患者的身心健康[1]，通常情況下疾病診斷時已為晚期，80%的患者出現播散性的瘤體形成[2]。目前，卵巢癌的治療主要是手術聯合化療，但多數患者在完成初級治療后復發[3]。2005年，Bapat等[4]率先發現卵巢癌干細胞(ovarian cancer stem cell，OCSC)，為卵巢癌的發生提供了新的理論依據。研究表明，除了OCSC外，卵巢癌中還存在具有干細胞特性的腫瘤細胞亞群[5]。腫瘤干細胞的研究中通常會選擇與干細胞相關的蛋白質作為觀察指標，目前已知的腫瘤干細胞標志物有很多，如分化抗原簇133(cluster of differentiation 133，CD133)、分化抗原簇44(cluster of differentiation 44，CD44)、分化抗原簇117(cluster of differentiation 117，CD117)、乙醛脫氫酶1家族成員A1(aldehyde dehydroge-nase, ALDH1A1)、分化抗原簇326(cluster of differentiation 326，CD326)及分化抗原簇24(cluster of differentiation 24，CD24)等[6-9]，其中CD133、CD44在卵巢癌中較為常見[10-11]。卵巢癌易發生轉移，除與本身的因素相關，還與趨化因子受體4(chemokine receptor 4，CXCR4)相關[12]。趨化因子-12(C-X-C motif chemokine ligand-12 ,CXCL12)是CXCR4特異性配體，二者在發育中至關重要，但也參與了多種病理過程[13]。目前小干擾核糖核酸(small interfering RNA，siRNA)介導基因沉默、腫瘤的免疫治療等對卵巢癌侵襲轉移方面的研究已很多[14]，但靶向阻斷CXCR4來探討其對OCSC特征影響方面的研究很少，因此，本研究擬通過檢測上皮性卵巢癌細胞中CXCR4的表達，并利用其靶向阻斷劑普樂沙福(AMD3100)處理卵巢癌細胞后，探究CXCR4對卵巢癌腫瘤細胞干細胞特征的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1細胞株和主要試劑 卵巢上皮癌細胞株(human ovarian cancer cell line-3, OVCAR-3)購自昆明醫科大學細胞庫中心，高糖培養基(dulbecco's modified eagle medium , DMEM)，AMD3100(美國MedChemExpress)，全細胞裂解液(radio-Immunoprecipitation assay，RIPPA)，1 ∶500 CXCR4抗體(美國R&D)，1 ∶500 CD133(美國Abcam)，1 ∶100 CD44抗體(美國CST)。

1.1.2主要儀器 SW-CJ-1FD超凈工作臺(蘇州金凈)，3111 CO2恒溫培養箱和FRESCO 21低溫離心機(美國Thermo)，4 ℃、-20 ℃ BCD-190TMPK冰箱(青島海爾)，B20-TEKELX800UV酶標儀(美國寶特)，ECLIPSE TS100光學顯微鏡及LHS-H100P-1顯微照相系統(日本 Nikon)，PowerpacTMBasic電泳儀(美國 BioRAD)。

1.2 方法

1.2.1細胞培養與分組 常規利用DMEM培養基將OVCAR-3細胞置于5%CO2的37 ℃恒溫培養箱中培養，每2～3 d更換1次培養基，取對數期細胞分為對照組(0 mg/L AMD3100處理)、低濃度組(10 mg/L AMD3100處理)及高濃度組(100 mg/L AMD3100處理)。

1.2.2Western blot試驗 取對數期各組細胞，裂解各組細胞收取細胞總蛋白，分離蛋白后脫脂，室溫封閉2 h根據蛋白量剪切條帶后分別加CXCR4、CD44及CD133抗體孵育，4 ℃過夜，TBST漂洗后，分別加二抗室溫孵育2 h漂洗，加DAB顯色液，待陽性區帶顯色清晰后拍照記錄。

1.2.3細胞懸浮成球實驗 取對數期各組細胞，將生長狀態良好的細胞消化后離心，去掉含血清的培養基，PBS清洗2次，干細胞培養基重懸細胞，將384懸滴板置于準備好的6孔板頂上，將重懸液接種于384懸滴板中，過濾的去離子水800 μL吸移到每個邊界貯存器中，在每個6孔板孔中加去離子水4～5 mL，進一步控制濕度；分別于加藥處理后第2天、第7天倒置顯微鏡計數直徑大于50 μm的懸浮球，計算并比較成球率(成球率=懸浮球/加入細胞數×100%)。

1.3 統計學分析

2 結果

2.1 CXCR4蛋白的表達

低濃度組和高濃度組OVCAR-3細胞的CXCR4蛋白表達分別低于對照組，且高濃度組也低于低濃度組，差異均有統計學意義(P<0.05)。見圖1。

注：A為蛋白印跡試驗結果，B為蛋白表達的定量結果；(1)與對照組比較，P<0.05；(2)與低濃度組比較，P<0.05。

2.2 CD133與CD44蛋白的表達

低濃度組和高濃度組OVCAR-3細胞中干細胞標志物CD133和CD44蛋白表達均分別低于對照組，且高濃度組也低于低濃度組，差異均有統計學意義(P<0.05)。見圖2。

注：A為蛋白印跡試驗結果，B、C分別為CD133和CD44蛋白表達的定量結果；(1)與對照組比較，P<0.05；(2)與低濃度組比較，P<0.05。

2.3 細胞懸浮成球能力

經AMD3100處理后，OVCAR-3細胞接種第2天時，對照組、低濃度組及高濃度組的細胞成球比例比較、差異均無統計學意義(P>0.05)；當OVCAR-3細胞培養至第7天時，對照組細胞懸浮成球的比例分別低于低濃度組和高濃度組，且低濃度組也低于高濃度組，差異均有統計學意義(P<0.05或P<0.01)。見圖3。

注：A為細胞懸浮成球試驗結果(10×)；B為腫瘤細胞懸浮成球比例的定量結果；與對照組比較，(1)P<0.05，(2)P<0.01；(3)與低濃度組比較，P<0.05。

3 討論

卵巢癌是常見的婦科腫瘤，其轉移和復發是卵巢癌患者死亡的原因[15]。CXCL12及其受體CXCR4在卵巢癌中高表達，并促進了卵巢癌的發展[16]，趨化因子是細胞運輸、相互作用及腫瘤發展的重要介質[12]，CXCR4與其特異性配體CXCL12結合后可激活CXCR4-CXCL12軸，增加了癌細胞的細胞增殖、遷移及侵襲[17]。CXCR4在卵巢癌的高表達，為卵巢癌的治療提供了新的思考，由于卵巢癌由于卵巢癌的耐藥性和全身性副作用，傳統的卵巢癌化療方法受到限制，靶向治療在卵巢癌的治療中顯得尤為重要，AMD3100與CXCR4具有高度親和力[18]，利用這一特性，展開本研究。本研究結果顯示，CXCR4在上皮性卵巢癌細胞中高表達，在利用AMD3100阻斷CXCR4后，CXCR4的表達降低，不同濃度對CXCR4表達的抑制也存在差異性。乳腺癌上皮循環腫瘤細胞上皮-間質轉化表型譜分析提示，CXCR4、CD44陽性的患者循環腫瘤細胞最具有攻擊性，淋巴結的轉移、腫塊的大小及死亡的風險都更嚴重[17]。Garg等[19]利用AMD3100阻斷CXCL12可減緩胰腺癌腫瘤生長，并增加細胞毒性T細胞的腫瘤浸潤；Erhart等[20]研究提示，所有研究的膠質瘤球體始終具有分子標記CD44/CD133陽性的細胞群；有關結腸直腸癌的研究也證實遠端邊緣富集CD133表達的患者，其復發率增加，無病生存率降低[21]。由此可以推斷，CXCR4、CD44及CD133都對腫瘤的發生和發展產生了一定的促進作用。Rasti等[22]研究提示CXCR4可以作為腎癌靶向治療的診斷和標記物；Abigail等[23]研究也顯示，CXCL12/CXCR4軸在子宮內膜異位癥細胞中可以促進細胞增殖、遷移和侵襲，同時誘導蛋白激酶B磷酸化和活性；Blagden[24]研究表明腫瘤內細胞亞群的異質性參與了腫瘤耐藥性的發生；Landencn等[25]發現腫瘤干細胞標志物陽性的腫瘤細胞亞群，其耐藥性更強，靶向治療時將使耐藥細胞對化療的厭惡更加敏感。因此，本實驗通過靶向阻斷CXCR4后，CD44和CD133的表達與對照組相比，明顯降低，懸浮成球的結果也表明靶向阻斷CXCR4后上皮性卵巢癌的懸浮成球能力明顯下降。

綜上所述，在上皮性卵巢癌細胞中，CXCR4可促進CD44和CD133的表達，靶向阻斷CXCR4可降低上皮性卵巢癌細胞的干細胞特征，但具體機制仍需進一步研究。