牛蒡苷元對血小板體外聚集作用的影響及機制*

潘彩燕，張蓉，林曉堅，袁兆偉，劉剛，謝娟

(1.貴州醫科大學 基礎醫學院 藥理學教研室，貴州 貴陽 550025；2.貴州醫科大學 藥學院，貴州 貴陽 550025；3.貴州省人民醫院 藥劑科，貴州 貴陽 550002)

牛蒡苷元(Arc-G)是中草藥牛蒡子中的有效活性成分之一[1]。近年來，越來越多的實驗證實了Arc-G對心血管類疾病具有預防和治療作用，有研究發現其具有降血壓與保護作用[2-3]、抗心律失常[4-5]、抗糖尿病[6-7]、抑制血管生長因子(PAF)誘導的血小板聚集[8]等藥理作用，但關于其對凝血酶、膠原、二磷酸腺苷(ADP)誘導的血小板聚集作用的影響未見報道。本文通過比濁法，觀察Arc-G對不同激動劑誘導的血小板聚集作用的影響；通過ELISA(酶聯免疫吸附測定法)實驗方法測定cAMP(環磷酸腺苷)、TXB2(血栓素B2)含量的變化，為進一步闡明Arc-G的藥理作用及防治血栓性疾病提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1實驗動物 SPF級昆明種小鼠50只，雌雄各半，體質量為18～22 g，將小鼠飼養于18～25 ℃環境下，提供充足的食物和飲用水，適應性喂養兩周后進行實驗。小鼠由貴州醫科大學實驗動物中心提供，實驗動物合格證號SCXK(黔)2018-0001。

1.1.2藥物與試劑 牛蒡苷元(麥克林試劑公司，批號18092808)，凝血酶(Sigma公司, 批號SLBV2136)，ADP(Sigma公司, 批號SLBL1267V)，膠原(Chrono-log公司，批號3483)，cAMP、TXB2ELISA試劑盒(江萊生物有限公司, 批號201903)

1.1.3實驗儀器 高速冷凍離心機(德國Eppendorf公司)，全自動血液細胞分析儀(深圳邁瑞生物醫療電子股份有限公司)，聚集儀(Chrono-log公司)

1.2 方法

1.2.1制備洗滌血小板[9]小鼠下腔靜脈取血，ACD抗凝(1 ∶9)，等體積加入1×臺式液稀釋，800 r/min離心20 min，吸取上層富含血小板液體，加入適量1×臺式液稀釋，加入前列腺素E1(PGE1，50 μg/L)、EDTA(1 mmol/L)，輕輕混勻后，2 000 r/min 離心10 min，棄去上清液，加入適量1×臺式液重懸血小板，2 000 r/min離心10 min，棄去上清液，1×臺式液重懸血小板；血液細胞分析儀檢測血小板數目，1×臺式液將血小板數目調整至3×1011個/L，室溫放置備用。

1.2.2凝血酶、膠原、ADP誘導的血小板聚集[10]小鼠洗滌血小板250 μL(3×1011個/L)加入反應杯中，分為模型組(1×臺式液)、替羅非班組(0.5 mg/L)、Arc-G低劑量組(3.125 μmol/L)和Arc-G高劑量組(12.5 μmol/L)，依次加入2.5 μL臺式液、替羅非班、Arc-G低劑量、Arc-G高劑量，37 ℃孵育 5 min；隨后加入2.5 μL CaCl2(100 mmol/L)，將反應杯放入血小板聚集儀，調整基線，加入不同激動劑誘導血小板聚集，在加入ADP之前，應先加入2.5 μL纖維蛋白(20 g/L)，觀察血小板聚集情況，3 min后停止記錄，并用軟件記錄血小板聚集率。血小板聚集抑制率=(對照組血小板最大聚集率-給藥組血小板最大聚集率)/對照組血小板最大聚集率×100%[9]。

1.2.3小鼠洗滌血小板cAMP的測定[11]洗滌血小板250 μL(3×1011個/L)加入反應杯中，分為模型組(1×臺式液)、PGE1組(1 μmol/L)、Arc-G低劑量組和Arc-G高劑量組，依次加入2.5 μL臺式液、PGE1、Arc-G低劑量、Arc-G高劑量，37 °C孵育 5 min；加入CaCl2(1 mmol/L)、凝血酶(250 U/L)，于聚集儀內12 000 r/min下攪拌5 min，加入乙二胺四乙酸二鈉(1 mmol/L)終止反應，h煮沸10 min，12 000 r/min離心10 min(4 ℃)，取上清液按試劑盒方法進行檢測。

1.2.4小鼠洗滌血小板TXB2的測定[12]按照1.2.2實驗進行分組、孵育后，加入CaCl2(1 mmol/L)、凝血酶(250 U/L)，于聚集儀內12 000 r/min下攪拌5 min，加入2×終止緩沖液(阿司匹林6 mmol/L、乙二胺四乙酸二鈉20 mmol/L)終止反應，冰上靜置8 min，12 000 r/min離心10 min(4 ℃)，取上清液按試劑盒方法進行檢測。

1.3 統計學處理

2 結果

2.1 凝血酶、膠原及ADP誘導

與模型組比較，Arc-G低劑量、Arc-G高劑量能明顯降低凝血酶誘導的血小板聚集率，差異有統計學意義(P<0.05)。見表1。與模型組比較，Arc-G低劑量、Arc-G高劑量不能降低膠原誘導的血小板聚集率。見表2。與模型組比較，Arc-G高劑量能顯著抑制由ADP誘導的血小板聚集率，差異有統計學意義(P<0.05)。見表3。

表1 Arc-G對凝血酶誘導小鼠血小板聚集率的影響

表2 Arc-G對膠原誘導小鼠血小板聚集率的影響

表3 Arc-G對ADP誘導小鼠血小板聚集率的影響

2.2 血小板cAMP水平

與模型組比較，血小板經過凝血酶刺激后，PGE1可明顯提高血小板中cAMP的含量，Arc-G低劑量、Arc-G高劑量也均明顯提高血小板中cAMP的濃度，差異均有統計學意義(P<0.05)。見表4。

表4 Arc-G對cAMP水平的影響

2.3 血小板TXB2水平

與模型組比較，替羅非班可明顯減少凝血酶誘導的血小板聚集后TXB2的含量，Arc-G低劑量、Arc-G高劑量也均明顯減少凝血酶誘導的血小板TXB2的含量，差異均有統計學意義(P<0.05)。見表5。

表5 Arc-G對血小板內TXB2水平的影響

3 討論

血小板是由成熟的巨核細胞脫落下來的小塊胞質，無細胞核，呈直徑為1～4 μm的圓盤狀[13]。參與機體生理性止血、炎癥反應及血栓形成等過程。血小板活化、聚集誘導的血栓形成在血栓性疾病的發生和發展中起關鍵作用。因此，減少血小板聚集是預防血栓形成的重要手段[14]。血小板細胞膜上存在著多種受體，凝血酶、膠原、ADP可與血小板細胞膜上的相應受體結合，誘導體內血小板發生聚集[15]。

凝血酶是血小板活化過程的一種關鍵酶，當血管內皮出現損傷，釋放出血漿因子、組織因子及血小板，促進凝血酶原致活物的生成，將凝血酶原轉變為凝血酶，致使血漿纖維蛋白原轉變成不溶性的纖維蛋白。凝血酶是啟動凝血、纖溶系統的核心要素，凝血酶可以作為研究血栓類疾病藥物的重要靶點[16]。在體外，凝血酶是最重要的血小板活化劑之一，低濃度的凝血酶可使血小板形狀發生改變、胞內鈣離子濃度增高，引起血小板活化[17]。血小板被激活后，存在于血小板致密顆粒內的ADP被釋放，進一步激活周圍循環血液中的血小板，加速血小板聚集。因此，ADP是血小板聚集和釋放的主要介質，能促進血小板聚集和血栓形成。本研究結果表明，Arc-G對凝血酶、ADP誘導的血小板體外聚集具有顯著的抑制作用，但其不能明顯抑制膠原誘導的血小板聚集。

cAMP廣泛存在于人和動物細胞中，以“第二信使”形式對細胞功能起著重要的調節作用[18]。研究發現，cAMP能夠顯著抑制血小板聚集，且其可以通過多種信號通路抑制血小板聚集，其能夠明顯抑制凝血酶、膠原、ADP等不同激動劑誘導的血小板聚集。cAMP主要是通過抑制Ca2+的釋放、降低胞內的Ca2+水平發揮抗血小板聚集的作用。化合物若能夠升高血小板內cAMP的水平，則對血小板的聚集具有顯著的抑制作用。另外，血小板微粒體可合成并釋放TXA2，能夠顯著促進血小板聚集。由于TXA2釋放后很快轉變為TXB2，因此，常檢測TXB2的含量用于表示TXA2的水平。實驗結果表明，與模型組比較，Arc-G能夠顯著提高cAMP的水平，降低TXB2的水平。說明Arc-G抑制血小板聚集的作用可能與該機制有關。

綜上所述，Arc-G拮抗凝血酶誘導血小板聚集作用的潛在分子機制可能是通過升高血小板內cAMP、降低TXB2的水平來實現的。