淫羊藿素對腹膜纖維化大鼠糖原合酶激酶3β、β連環蛋白的影響

李林煜，陳 燁，甘 平

(1.貴州醫科大學，貴州 貴陽550000；2.貴州醫科大學附屬醫院，貴州 貴陽550004)

腹膜透析(Peritoneal dialysis，PD)是一種治療終末期腎病(End-stage renal disease，ESRD)經濟有效的腎臟替代療法[1]。但腹膜組織長期暴露于生物不相容的高葡萄糖PD液(PDF)會使腹膜進行性損傷，導致腹膜纖維化[2]。目前腹膜纖維化的發生機制尚不清楚，尚無有效的治療方法。關于腹膜纖維化的發病機制中醫學目前沒有相關的描述，但一些醫學家認為腹膜纖維化的中醫發病機制為脾腎虧虛、痰瘀互結等。研究顯示淫羊藿為小檗科淫羊藿屬植物，是一種傳統中草藥，具有增強人體免疫功能、延緩衰老、防治神經性疾病等作用，淫羊藿素是從淫羊藿中提取的一種異戊二烯類黃酮衍生物，具有抗腫瘤、抗骨質疏松等作用[3]。目前尚不了解淫羊藿素在透析誘導的腹膜纖維化中的抗纖維化作用。β連環蛋白(β-catenin)信號在體內自我更新中發揮重要作用，在腎臟纖維化、肺纖維化、肝纖維化和皮膚纖維化中涉及上皮間充質轉化的啟動[4-6]。糖原合酶激酶3β(Glycogen synthase kinase 3β，GSK-3β)在上述病理中抑制β-catenin信號傳導中起關鍵作用[7]。由此，本研究擬探討淫羊藿素對腹膜纖維化的作用效果及對GSK-3β、β-catenin的影響，為淫羊藿素治療腹膜纖維化的臨床應用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗動物:成年雄性SPF級SD大鼠30只，體重(210±10)g。購于成都達碩實驗動物有限公司，使用許可證號：SCXK(川)2019-031。飼養于恒溫(20～25 ℃)、恒濕(50±5)%環境中，自然采光，自由飲水。

1.1.2 主要試劑及儀器:淫羊藿素購自上海友思生物技術公司；0.1%葡萄糖氯已定購于美國Sigma；蘇木素染液(批號：C200301)、伊紅染液(批號：C200403)購自珠海貝索生物技術有限公司；改良Masson三色染色液(批號：0630A20)購自合肥博美生物科技有限責任公司；GSK-3β、β-Catenin ELISA試劑盒購自上海茁彩生物科技有限公司；相關一抗GSK-3β、β-catenin、p-GSK-3β購自CST，二抗購自英國Abcam公司；RS36型全自動染色機購自常州派斯杰醫療設備公司；病理組織漂烘儀(PHY-Ⅲ型)購自常州市中威電子儀器；BA210Digital數碼三目攝像顯微鏡購自麥克奧迪實業集團。

1.2 實驗方法

1.2.1 腹膜纖維化大鼠模型構建及干預方法:大鼠適應性飼養7 d后，隨機分為假手術組(10只)及造模組(20只)。模型組每日給予0.1%葡萄糖氯已定(1 ml/100 g)腹腔注射，假手術組每日給予1 ml生理鹽水腹腔注射，連續21 d。21 d后造模大鼠隨機分為模型組、淫羊藿素組，隨后假手術組和模型組大鼠灌胃生理鹽水，淫羊藿素組按3 mg/kg淫羊藿素灌胃，淫羊藿素劑量選擇是根據前期體內淫羊藿素(0.1～10 mg/kg)處理的預實驗結果選用3 mg/kg劑量給藥，每天給藥1次，持續6周。

1.2.2 標本采集:三組大鼠于末次給藥結束24 h后，處死大鼠，分別取腹膜組織，將腹膜組織分為三部分，一部分采用4%多聚甲醛固定，用于病理觀察及免疫組化染色；另一部分于-80 ℃冰箱保存，用于ELISA檢測；剩余部分于液氮中保存，用于后續Western blot檢測。

1.2.3 腹膜組織病理變化觀察:HE染色方法為，腹膜組織4%多聚甲醛固定，包埋在石蠟中，然后切成切片(約5 μm厚)，根據說明書對樣品進行了蘇木精-伊紅(HE)染色，觀察腹膜組織的病理變化，并用光學顯微鏡拍照。Masson染色：腹膜組織4%多聚甲醛固定，包埋在石蠟中，切成5 μm的橫截面，使用Masson的三色染色劑，將腹膜組織分別染成紅色和藍色，觀察腹膜組織膠原纖維變化，并用光學顯微鏡拍照。

1.2.4 免疫組織化學法:固定的腹膜組織脫水，包埋，切片，使用磷酸鹽緩沖液(PBS)中的0.3%過氧化氫抑制這些切片中的內源性過氧化物酶活性，并用10%的正常山羊血清封閉非特異性蛋白結合位點。然后將切片與抗GSK-3β、抗β-catenin抗體4 ℃過夜，后與辣根過氧化物酶標記的抗兔IgGs二抗37 ℃孵育30 min，蘇木素染色，鏡檢觀察，并使用Image-J圖像分析軟件根據積分光密度(IOD)/面積值確定GSK-3β、β-catenin陽性染色的強度。

1.2.5 ELISA檢測:取腹膜組織，剪碎后加入預冷的生理鹽水3 ml，4 ℃下研磨，3500 r/min低溫離心10 min，取上清液，用于分析GSK-3β、β-catenin含量。通過相應的ELISA分析試劑盒檢測，所有步驟均按照說明書進行。設空白孔、標準品孔、待測樣品孔，其中空白孔不加樣品，只加顯色劑A、B和終止液用于調零；標準品孔加入配好的標準品50 μl，然后加入辣根過氧化物酶100 μl；待測樣品孔加入樣本50 μl，然后辣根過氧化物酶100 μl，蓋上封板膜，輕輕振蕩混勻，37 ℃溫育60 min。揭膜，棄去液體，于每孔加滿洗滌液后靜置1 min，棄去液體，重復5次。每孔先加入底物液A 50 μl，再加入底物液B 50 μl，輕輕震蕩混勻，37 ℃避光顯色15 min。每孔加終止液50 μl，終止反應。在15 min內，450 nm波長依序測量各孔的吸光度(OD值)。

1.2.6 Western blot分析:將每個樣品在裂解緩沖液中裂解以獲得總蛋白質，然后通過十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離該蛋白質，并轉移到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上。在5%脫脂牛奶中封閉60 min后，將膜與一抗GSK-3β、p-GSK-3β、β-catenin、β-actin在4 ℃孵育過夜。然后將膜用tris緩沖鹽水Tween(TBST)洗滌，并與辣根過氧化物酶(HRP)偶聯的山羊抗兔或抗小鼠二抗在室溫下孵育1 h。使用增強的化學發光檢測試劑觀察蛋白條帶，并使用Image-J軟件通過光密度法定量。條帶的灰度值標準化為β-actin，并表示為相對于對照的倍數變化，實驗重復3次。

1.3 統計學方法 采用SPSS 20.0統計學軟件進行分析，試驗數據均以均數±標準差表示，組間差異采用t檢驗統計分析，P<0.05表示差異具有統計學意義。

2 結 果

2.1 各組大鼠腹膜組織病理變化 假手術組：腹膜組織結構較為完整、清晰，未見明顯增厚；表面被覆單層扁平上皮，排列較為整齊，間皮下可見疏松結締組織，未見明顯纖維增生或炎細胞浸潤；腹膜下肌束結構清晰，肌束內肌細胞呈長圓柱狀，胞核呈扁圓形或橢圓形，位于細胞周緣，胞質染色較為均勻，未見明顯變性壞死。模型組：腹膜組織明顯增厚，間皮細胞排列紊亂；間皮下大量纖維組織增生，膠原纖維增多，腹膜組織厚度增加，增生纖維組織較為致密，平行排列成束，成纖維細胞、纖維細胞穿插于纖維束間，增生區域內可見大量血管增生及淋巴細胞浸潤，局部血管充血擴張較為明顯；腹膜下肌細胞變性壞死，見肌細胞基本結構丟失，大量肌細胞萎縮溶解。淫羊藿素組：腹膜組織增厚，纖維組織不同程度增生，可見成纖維細胞或淋巴細胞聚集于新生纖維束間；腹膜下部分肌細胞變性，見肌細胞輕微萎縮，腹膜組織間皮下致密層增厚程度減輕，膠原纖維較模型組減少(圖1)。

圖1 各組大鼠腹膜組織病理變化(×400)

2.2 各組大鼠腹膜組織GSK-3β、β-catenin蛋白相對表達比較 見表1(圖2)。與假手術組比較，模型組大鼠腹膜組織GSK-3β、β-catenin蛋白含量明顯升高(P<0.05)。與模型組比較，淫羊藿素組大鼠腹膜組織GSK-3β、β-catenin蛋白含量明顯降低,差異具有統計學意義(P<0.05)。

表1 各組大鼠腹膜組織GSK-3β、β-catenin蛋白相對表達比較

圖2 各組大鼠GSK-3β、β-catenin免疫組化染色圖(IHC染色，×200)

2.3 各組大鼠腹膜組織GSK-3β、β-catenin含量比較 見表2。與假手術組比較，模型組大鼠腹膜組織GSK-3β、β-catenin水平明顯升高(P<0.01)。與模型組比較，淫羊藿素組大鼠腹膜組織GSK-3β、β-catenin水平明顯降低(P<0.05)。

表2 各組大鼠腹膜組織GSK-3β、β-catenin含量比較

2.4 各組大鼠腹膜組織GSK-3β、p-GSK-3β、β-catenin蛋白相對表達比較 見表3(圖3)。與假手術組比較，模型組大鼠腹膜組織中GSK-3β、p-GSK-3β、β-catenin蛋白相對表達明顯升高(P<0.05)；與模型組比較，淫羊藿素組大鼠腹膜組織中GSK-3β、p-GSK-3β、β-catenin蛋白相對表達明顯降低(P<0.05)。

表3 各組大鼠腹膜組織GSK-3β、p-GSK-3β、β-catenin蛋白相對表達比較

圖3 各組大鼠腹膜組織GSK-3β、p-GSK-3β、β-catenin蛋白表達

3 討 論

腹膜纖維化是長期腹膜透析(PD)引起的嚴重并發癥，其特征是間皮細胞丟失和細胞外基質沉積[8]，因此開發腹膜纖維化的潛在治療策略尤為重要。中醫認為腹膜纖維化的發病機制為脾腎虧虛、痰瘀互結、久病入絡，從而導致腹絡微型癥積。

淫羊藿(Epimedium brevicomu Maxim.)又名仙靈脾、陰陽活、銅絲草、巴倫草，味甘、辛，性溫，歸腎、肝經，《玉楸藥解》注其功效：“榮筋強骨，起痿壯陽，溫補肝腎，滋益精血，治陰絕不生，陽痿不舉，消瘰疬，起癱瘓，益志寧神，清風明目”[9]?！侗静菥V目》認為淫羊藿有“益精氣，堅筋骨，補腰膝，強心力”之功效，對于腎陽虛導致的骨質疏松癥療效顯著。因此，淫羊藿也被廣泛用于治療絕經后骨質疏松癥[10]。淫羊藿最早記載見于《神農本草經》，藥理作用有補腎壯陽、祛風除濕等，現代醫學研究表明淫羊藿素已被臨床證明對一系列腫瘤、骨質疏松等疾病有效，此外，在神經保護、心臟保護、抗炎、抗肝纖維化等方面具有顯著藥理作用[11]。研究報道淫羊藿素可顯著抑制血清促炎細胞因子的分泌和產生，包括前列腺轉腺癌小鼠中的白細胞介素(IL-1α、IL-β、IL-6)和腫瘤壞死因子TNF-α[12]。此外，淫羊藿素還可通過激活5’-單磷酸腺苷(AMP)激活的蛋白激酶(AMPK)并抑制β位點APP裂解酶1(BACE-1)發揮抗阿爾茨海默氏癥作用[13]。Zhao等[14]發現淫羊藿素通過抑制IL-6和TNF-α的表達并通過AMPK/mTOR信號通路抑制肺癌破骨細胞的形成。Hwang等[15]報道淫羊藿素可通過刺激Nrf2/ARE和降低AP-1和NF-κB信號通路恢復UVB誘導的光老化。淫羊藿素還可調節硬化素的表達，促進骨髓間充質干細胞的成骨[16]。但淫羊藿素對腹膜纖維化的保護作用機制尚不清楚。因此，本研究建立腹膜纖維化大鼠，觀察淫羊藿素抗纖維化作用。首先從病理角度觀察結果顯示淫羊藿素可減輕腹膜增厚，減輕間皮下大量纖維組織增生，改善局部血管充血擴張，并減少腹膜組織膠原纖維。提示淫羊藿素對腹膜纖維化具有改善作用，可成為治療腹膜纖維化的潛在治療藥物。

淫羊藿素已被表明可通過多靶點，多途徑作用于各種疾病[11]。研究報道GSK-3β是Wnt信號通路中的重要信號因子，在各種細胞內均廣泛存在，可通過Wnt信號通路調節細胞的代謝、增殖和凋亡等多種進程[17]。Zhang等[18]證實GSK-3β在纖維化中占有重要作用，抑制GSK-3β的表達可以抑制肺纖維化的發生與進展，并提出GSK-3β可能是肺纖維化治療的一個潛在靶點。β-catenin是通過Axin、腺瘤性息肉病大腸桿菌、酪蛋白激酶1α(CK1α)和GSK-3β組成的破壞復合體維持在較低水平，GSK-3β磷酸化抑制破壞復合物的泛素化活性，導致胞內β-catenin的積聚，隨后遷移到細胞核[19]。核β-catenin與T細胞因子/淋巴增強因子結合因子(TCF/LEF)家族成員形成復合物，刺激靶基因的轉錄，包括Snail、Twist、纖維連接蛋白(fibronectin)、MMPs、Jagged1和LEF1，促進細胞增殖[20]。研究表明抑制β-catenin可阻斷高糖誘導的腎小管上皮細胞轉分化[21]。Yan等[22]研究表明β-catenin通路可能在高糖誘導的腹膜纖維化過程中促進腹膜間質轉化。本研究表明，淫羊藿素可抑制葡糖糖氯已定誘導的腹膜纖維化大鼠GSK-3β、β-catenin表達，提示淫羊藿素可能通過抑制GSK-3β的磷酸化，促進GSK-3β降解，減少β-catenin蓄積，減輕腹膜纖維化。

綜上所述，淫羊藿素通過減輕腹膜增厚及腹膜組織膠原纖維進展，抑制GSK-3β/β-catenin軸的激活，減輕葡糖糖氯已定誘導的腹膜纖維化。