扶腎方對尿毒癥腹膜透析大鼠腹膜功能及VEGF、TNF-α、IL-12、IFN-γ 的影響

楊 波王孟孟孫 林李 潔喬延恒楊洪濤*

(1.天津中醫藥大學第一附屬醫院腎病科,天津 300381； 2.安徽省阜陽市第四人民醫院內分泌科,安徽 阜陽 236021)

腹膜透析(peritoneal dialysis,PD)作為主要的腎替代治療方法之一,極大的提高了終末期腎病(end stage renal disease,ESRD)患者的生存質量。但是由于患者長期使用生物不相容性的腹膜透析液,腹膜的超濾功能逐漸減退,終致超濾衰竭,將迫使患者退出腹膜透析治療[1]。 研究表明,腹膜血管新生是導致超濾衰竭的主要原因之一[2]。 因此,采取有效策略抑制腹膜血管新生,維持腹膜有效超濾是保證PD 患者長期存活的關鍵。 中藥復方因其多靶點調節的特點,在抑制腹膜血管新生方面面具有較好前景[3], 扶腎方(院內制劑: 津藥制字Z20130941)由生黃芪、當歸、陳皮、半夏、丹參、鬼箭羽、熟軍、仙靈脾組方,具有健脾益腎、通腑降濁的功效。 本研究利用5/6 腎切除尿毒癥大鼠PD 模型,模擬人體內PD 過程,觀察扶腎方對尿毒癥大鼠腹膜形態、腹膜功能及腹膜組織血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)、腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)、白介素-12(interleukin-12,IL-12-)及干擾素-γ(interferon-γ,IFN-γ)的影響,為扶腎方防治PD 超濾衰竭提供新的思路與方法。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

雄性SPF 級SD 大鼠50 只,鼠齡6 ～8 周,體重200～250 g,購自北京維通利華實驗技術有限公司[SCXK(京)2016-0006]。 飼養于天津中醫藥大學動物房內[SYXK(津)2018-0002]。 本研究經天津中醫藥大學動物實驗倫理委員會批準(TCMLAEC2019067),在整個實驗過程中依照“3R”原則給予實驗動物人道主義關懷。

1.2 主要試劑與儀器

1.5%及4.25%雙聯腹膜透析液,廣州百特醫療用品有限公司；扶腎方飲片購于天津中醫藥大學第一附屬醫院；塞來昔布(批號:J20140072),美國輝瑞制藥有限公司；尿素氮(BUN)(C013-2)和肌酐(Cr)(C011-2)測定試劑盒購自南京建成生物工程研究所；HE 染色試劑盒(G1120)購自北京索萊寶科技有限公司；葡萄糖檢測試劑盒購自上海榮盛生物醫藥有限公司；液相芯片試劑盒(RECYTMAG-56K)購自美國MILLIPORE 公司。 Luminex 200 液相芯片分析儀(美國Luminex 公司)；紫外可見分光光度計(T6 新世紀),北京普析通用儀器有限責任公司；-80℃超低溫冰箱(BCD-215KS),青島海爾股份有限公司；7100 型日立全自動生化分析儀購自日本日立公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 實驗分組

50 只SD 大鼠常規飼養,適應環境1 周后,按隨機數字表法隨機分為正常對照組(Control)、模型組(Model)、扶腎方低劑量組(FSF-L)、扶腎方高劑量組(FSF-H)、塞來昔布組(Cel),每組10 只。

1.3.2 扶腎方制備

扶腎方組成:陳皮10 g、半夏15 g、黃芪15 g、當歸10 g、仙靈脾15 g、丹參30 g、熟軍10 g、鬼箭羽30g。 扶腎方以中藥飲片為原料,經過提取、分離、濃縮、干燥、制粒而成。 按照藥物人和大鼠體表面積計算方法,折算系數為0.018。 扶腎方顆粒成人服用劑量為每次18 g,按照折算系數計算出大鼠等效劑量為0.324 g,每日2 次。

1.3.3 動物造模與給藥

正常對照組大鼠不進行任何處理,其余各組大鼠行5/6 腎切除術,術后1 周檢測腎功能。 各組腎功能達標后,腹腔注射1.5%腹膜透析液,按每日100 mL/kg,以大鼠右下腹靠近腹股溝中點為穿刺注射部位,各組所注射液體均腹腔內保留,不抽出。模型組在規律腹腔注射腹膜透析液同時每日生理鹽水2 mL 灌胃,連續4 周；扶腎方低劑量組在規律腹腔注射腹膜透析液同時每日扶腎方324 mg/mL,2 mL/d 灌胃,連續4 周；扶腎方高劑量組在規律腹腔注射腹膜透析液同時每日扶腎方648 mg/mL,2 mL/d 灌胃,連續4 周；塞來昔布組在規律腹腔注射腹膜透析液同時每日塞來昔布溶液1.8 mg/mL,每天灌胃2 mL,連續4 周；正常對照組予每日生理鹽水2 mL 灌胃,連續4 周。

1.3.4 大鼠血清肌酐和尿素氮水平的檢測

在右腎切除術后第4 周從大鼠眶后靜脈叢取血,低溫高速離心機3500 r/min 離心10 min,留取上清液,應用全自動生化分析儀檢測各組大鼠血清肌酐和尿素氮的水平。

1.3.5 各組大鼠腹膜組織HE 染色

取大鼠壁層腹膜組織,常規固定、脫水、石蠟包埋、切片后,行蘇木精-伊紅(HE)染色,光鏡下觀察大鼠腹膜形態學變化。

1.3.6 各組大鼠腹膜功能檢測

行腹膜平衡實驗,檢測大鼠腹膜轉運功能,方法:各組大鼠殺檢前,每只大鼠腹腔注射4.25%腹膜透析液25 mL,4 h 后麻醉大鼠,抽取腹腔液體量,打開腹腔,將干紗布消毒,稱重后置入腹腔,以吸取未抽凈的腹透液,后再稱取紗布質量。 同時分別留取腹透液標本,1500 r/min 離心5 min,留取上清液,紫外分光光度計檢測每組腹膜透析液的葡萄糖濃度,根據檢測結果計算超濾量和葡萄糖轉運量。 超濾量=(紗布吸水后的質量-紗布的質量)× 1 mL/g+引流量-腹腔注射量；葡萄糖轉運量(mmol/kg)=(透析液初始葡萄糖濃度×注入透析液體積)-(透析末葡萄糖濃度×終末透析液出量)。

1.3.7 大鼠腹膜組織VEGF、TNF-α、IL-12 和IFN-γ含量檢測

適量腹膜組織進行勻漿后,取上清液,采用Luminex200 液相芯片分析儀進行VEGF、TNF-α、IL-12、IFN-γ 檢測。

1.4 統計學方法

采用SPSS 22.0 軟件進行統計學分析。 符合正態分布的計量資料用平均數±標準差(±s)表示,不符合正態分布的資料用中位數(四分位數間距)表示,多組比較采用單因素方差分析,以Levene 法進行方差齊性檢驗,若方差齊,采用LSD-t法,若方差不齊,采用Games-Howell 法。P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 建立大鼠尿毒癥模型

尿毒癥組大鼠血清肌酐和尿素氮濃度為正常對照組的2 ～3 倍,表明大鼠尿毒癥模型造模成功[4-5]。 見表1。

2.2 各組大鼠腹膜組織HE 染色

正常對照組大鼠腹膜組織較連續和完整,腹膜間皮細胞呈扁平狀態,模型組腹膜組織明顯增厚,部分呈柱形,還可見到間皮細胞的脫落,炎細胞浸潤等病理變化。 扶腎方及塞來昔布干預后,炎性細胞浸潤、腹膜增厚較模型組減輕。 見圖1。

2.3 各組大鼠腹膜功能

腹膜平衡實驗結果,與正常對照組比較,模型組、扶腎方低劑量組、扶腎方高劑量組及塞來昔布組超濾量均明顯下降,模型組、扶腎方低劑量組葡萄糖轉運量均增加,差異有統計學意義(P＜0.05)。與模型組比較,扶腎方高劑量組超濾量明顯增加,扶腎方高劑量組及塞來昔布組葡萄糖轉運量明顯下降,差異有統計學意義(P＜0.05)。 見表2。

2.4 扶腎方對各組大鼠腹膜組織VEGF、TNF-α、IL-12 和IFN-γ 含量的影響

與正常對照組比較,模型組大鼠腹膜組織VEGF、TNF-α 表達上調,IL-12、IFN-γ 的表達下調,差異有統計學意義(P＜0.05,P＜0.01)。 與模型組比較,扶腎方低劑量組VEGF、TNF-α 表達下調,IL-12、IFN-γ 表達上調,差異有統計學意義(P＜0.05,P＜0.01)；扶腎方高劑量組和塞來昔布組VEGF 表達下調,IL-12、IFN-γ 表達上調,差異具有統計學意義(P＜0.01)。 見表3。

表1 正常對照組與尿毒癥組大鼠腎功能比較Table 1 Comparison of renal function between normal control group and uremic group rats

注:A:正常對照組；B:模型組；C:扶腎方低劑量組；D:扶腎方高劑量組；E:塞來昔布組。圖1 各組大鼠腹膜組織HE 染色Note. A, Control group. B, Model group. C, FSF-L group. D,FSF-H group. E, Cel group.Figure 1 HE staining of peritoneal tissues of rats in each group

表2 各組大鼠超濾量、葡萄糖轉運量的變化Table 2 Changes in ultrafiltration volume and glucose transport of rats in each group

3 討論

腹膜透析是終末期腎病患者腎替代治療的主要方式之一,但PD 相關的腹膜超濾衰竭是長程PD患者面臨的嚴峻問題。 其中腹膜血管新生是引起超濾衰竭的重要原因,新生的腹膜血管增加了腹膜毛細血管交換面積,造成小分子溶質高轉運,葡萄糖快速被腹膜吸收,腹腔的滲透濃度梯度快速消失,從而出現腹膜超濾減少,患者體內水分和尿毒素不能有效清除,極易出現心臟超負荷,終致患者退出PD,甚則危及生命。 有研究表明[6],抑制腹膜血管新生,有助于減少腹膜粘連、延緩腹膜纖維化進程,其保護腹膜功能的作用比抑制腹膜纖維化更強。 腹膜血管新生發生的原因和機制復雜,受非生物相容性腹透液和炎癥狀態等因素影響。 現代醫學主要采用改善腹透液生物相容性、預防腹膜炎等手段抑制腹膜血管新生,防治腹膜超濾衰竭。 部分單味及復方中藥中藥具有抑制腹膜血管新生、抗腹膜纖維化的作用,中醫藥減輕腹膜血管新生,防治腹膜超濾衰竭備受研究者的關注。 研究表明,黃芪甲苷、丹參酮、大黃素、腎康注射液等可改善由高糖腹透液誘導的大鼠腹膜功能減退,防治腹膜纖維化[7]。

Hanahan 等[8]在上世紀九十年代提出了血管生成與血管生成促進因子和血管生成抑制因子的表達有關,也就是有關血管生成的開關平衡假說,即血管穩態的維持,需要血管生成促進因子和抑制因子的共同調控,若兩種因子的表達失衡,就可能誘發血管新生化,引起病理性的血管新生。 VEGF 是內皮細胞最具特異性的生長因子,主要功能是誘導內皮細胞增殖、分化和遷移,是血管新生的標志性指標[9]。 有研究表明[10],在尿毒癥和高糖腹透液的刺激下,腹膜組織高表達血管生成促進因子VEGF,并和腹膜血管新生程度呈正相關；應用血管生成抑制劑可使VEGF 表達下調,減輕腹膜血管新生。TNF-α 是由一種活化的單核細胞、巨噬細胞合成和分泌的、最重要的炎癥因子之一。 研究發現TNF-α可以促進血管內皮細胞的增殖,與VEGF 同樣都具有促進血管生成的作用[11-12],IL-12 是由抗原提呈細胞和B 細胞產生,是一種異源二聚體形式的前炎癥細胞因子,并以這種形式分泌到細胞外。 IL-12 能誘導IFN-γ 產生,在體內免疫應答中它也是IFN-γ產生所必需。 研究表明,IL-12 與IFN-γ 都具有抑制血管生成的作用,IL-12 與IFN-γ 表達上調,能夠減少VEGF 的生成,發揮抑制血管新生的作用[13-14]。塞來昔布是一種環氧化酶-2 抑制劑,可特異性抑制環氧化酶-2,減少VEGF 的生成,從而抑制腹膜血管新生,目前在實驗研究中得到廣泛應用[15-16]。 筆者課題組前期研究發現,扶腎方可通過調節尿毒癥腹膜透析大鼠腹膜組織TGF-βRⅠ、TGF-βRⅡ的表達抑制腹膜間皮細胞EMT,改善腹膜纖維化及腹膜超濾功能[17]。

本研究采用大鼠5/6 腎切除建立尿毒癥模型后,進行腹腔注射腹膜透析液,成功復制尿毒癥腹膜透析大鼠模型,并觀察了扶腎方對尿毒癥腹膜透析大鼠腹膜組織的形態學、腹膜的超濾功能及葡萄糖轉運功能,以及腹膜組織血管生成促進因子和血管生成抑制因子VEGF、TNF-α、IL-12、INF-γ 表達的影響。 研究顯示,模型組腹膜組織明顯增厚,部分呈柱形,還可見到間皮細胞的脫落,炎細胞浸潤等病理變化。 扶腎方及塞來昔布干預后,炎性細胞浸潤、腹膜增厚較模型組減輕。 腹膜平衡實驗結果表明,與模型組比較,扶腎方高劑量組超濾量明顯增加,扶腎方高劑量組及塞來昔布組葡萄糖轉運量明顯下降,差異有統計學意義。 與正常對照組比較,尿毒癥腹膜透析模型組大鼠腹膜組織中VEGF、TNF-α 的表達明顯上調,IL-12、IFN-γ 的表達明顯下調；與模型組比較,扶腎方低劑量組、扶腎方高劑量組和塞來昔布組均能下調VEGF、TNF-α 表達,上調IL-12、IFN-γ 的表達。 扶腎方的作用與塞來昔布類似。 筆者推測在5/6 腎切除大鼠尿毒癥腹膜透析模型中,扶腎方可改善腹膜組織形態學變化,并通過下調腹膜組織中血管生成促進因子VEGF、TNF-α的表達,上調血管生成抑制因子IL-12、IFN-γ 的表達,達到改善腹膜功能,防治超濾衰竭的作用。

中醫學認為,本虛標實為尿毒癥的基本病機,本虛主要為脾腎虧虛,標實表現為濕濁、瘀血,濁、瘀主要由脾腎虧虛導致。 患者行PD 治療后,仍不失尿毒癥病機關鍵,故脾腎虧虛、濕濁瘀血內蘊為PD 相關腹膜超濾衰竭的主要病機。 扶腎方是根據以上病機關鍵而組成的臨床效方,由黃芪、當歸、陳皮、半夏、淫羊藿、熟軍、丹參、鬼箭羽組成,主要功效為“健脾益腎,化瘀降濁”,組方融中醫“補、和、消”三法于一體,前期臨床及基礎研究表明,該方能顯著改善尿毒癥PD 大鼠腎功能,延緩PD 腹膜纖維化,改善腹膜超濾衰竭[17-18],但其具體作用機制尚不明確。

表3 扶腎方對各組大鼠腹膜組織VEGF、TNF-α、IL-12 和IFN-γ 含量的影響Table 3 Effect of FSF on VEGF, TNF-α, IL-12 and IFN-γ contents in peritoneal tissue of rats in each group

綜上所述,本研究從動物實驗初步證實,扶腎方具有減輕尿毒癥腹膜透析大鼠腹膜損傷、改善腹膜超濾衰竭的作用,該作用可能與下調腹膜組織血管生成促進因子VEGF、TNF-α 的表達,上調血管生成抑制因子IL-12、IFN-γ 的表達有關,但扶腎方調控腹膜血管新生的具體作用機制還需進一步深入探索。