沙庫巴曲纈沙坦通過調(diào)控心力衰竭大鼠TGF-β1/Smad3 和NF-κB 信號通路抑制心肌損傷

宋建敏陳 燦宋 波

(1.湖北醫(yī)藥學院附屬隨州醫(yī)院心血管內(nèi)科,湖北 隨州 441300； 2.湖北醫(yī)藥學院附屬隨州醫(yī)院心胸血管外科,湖北 隨州 441300)

心肌梗死在全世界范圍內(nèi)具有較高的致殘率和死亡率。 盡管由于早期溶栓、經(jīng)皮冠狀動脈介入治療或冠狀動脈搭橋術明顯降低了急性心肌梗死的死亡率,但幸存患者中仍會發(fā)生左心室(LV)重塑[1]。 心肌梗死后這種不良的心臟重塑可導致心室功能障礙和心力衰竭,從而導致預后不良和死亡率升高[2]。 心力衰竭是心肌梗死的主要并發(fā)癥,其在心肌梗死患者死亡原因中位于第二位[3]。 因此,抑制心臟重塑是治療心肌梗死后心力衰竭的主要策略。

心肌梗死后左心室間質纖維化和炎性細胞浸潤是心臟重塑的常見病理特征。 轉化生長因子-β1(TGF-β1)已被確認為心臟纖維化的關鍵調(diào)節(jié)劑,其可影響細胞生長、凋亡和分化、增加膠原蛋白和基質蛋白的產(chǎn)生、保持成纖維細胞的活力。 心肌梗死動物模型的結果表明,心肌梗死中TGF-β1 的高表達以及使用TGF-β 受體抑制劑阻斷TGF-β 途徑可以減輕心肌梗死動物模型中的心臟纖維化[4]。 此外,核因子κB(NF-κB)是心肌梗死后心臟重塑和心力衰竭發(fā)展的關鍵因素,并且在炎癥和先天免疫中起著至關重要的作用[5]。 NF-κB 家族成員p65 形成同二聚體或異二聚體,這些同二聚體或異二聚體與細胞質中的κB(IκB)蛋白抑制劑結合。 IκB 的降解會釋放NF-κB 二聚體,并使NF-κB 易位進入細胞核,從而可以啟動靶基因的轉錄。 NF-κB 的激活可誘導趨化因子(MCP-1)、細胞因子(TNF-α、IL-6)和基質金屬蛋白酶(MMPs)的轉錄,并進一步促進炎癥和纖維化[6]。 多項研究表明抑制NF-κB 可抑制炎癥反應和心臟纖維化[6]。 因此,研究TGF-β1 和NF-κB 信號通路對于抑制心肌梗死后心力衰竭患者的心臟重塑具有巨大的潛在治療價值。

沙庫巴曲纈沙坦(sacubitril/valsartan)的商品名叫諾欣妥(entresto),是一種血管緊張素II 受體及腦啡肽酶的雙重抑制劑類藥物,由血管緊張素II 受體拮抗劑的纈沙坦及腦啡肽酶抑制劑前體AHU377 組成[7]。 沙庫巴曲纈沙坦于2015 年獲美國FDA 批準上市,2016 年被推薦為心力衰竭指南的I 類藥物,并且取得了較好的療效。 然而,沙庫巴曲纈沙坦對心臟重塑的作用機制尚不明確。 因此,本研究建立了心肌梗死后心力衰竭模型,評估了沙庫巴曲纈沙坦對心臟功能、心臟纖維化以及TGF-β1、p-Smads、collagen I、TNF-α 和IL-6 的影響。 并進一步探討TGF-β1 和NF-κB 通路是否參與心臟重塑過程中沙庫巴曲纈沙坦的保護作用。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

60 只SPF 級雄性Sprague-Dawley 大鼠(7 周齡,體重220 ～250 g) 由湖北省實驗動物中心提供[SCXK(鄂)2019-0008],飼養(yǎng)于湖北醫(yī)藥學院屏障環(huán)境中[SYXK(鄂)2019-0031]。 給動物飼喂標準飼料和水,并飼養(yǎng)在12 h 光照和12 h 黑暗、(20±2)℃溫度和(50±2)%濕度的環(huán)境中。 所有動物實驗方案均已獲得湖北醫(yī)藥學院附屬隨州醫(yī)院倫理審查委員會的批準(20180211),并符合實驗室動物管理和使用規(guī)定,實驗設計符合3R 原則。

1.2 主要試劑與儀器

沙庫巴曲纈沙坦( 諾新妥, 國藥準字J20171054,Novatis Pharma Stein AG)；Masson 三色染色劑染色(貨號:G1340,北京索萊寶科技有限公司)；α-SMA 一抗(免疫組化) (ab119952,英國Abcam 公司)；HRP-聚合物標記的抗兔IgG 二抗(ab6721,英國Abcam 公司)；RIPA 裂解緩沖液(產(chǎn)品編號:P0013 K,碧云天生物技術研究所)；TGF-β1一抗(ab215715,英國Abcam 公司)；p-Smad3 和Smad3 一抗(ab52903 和ab40854,英國Abcam 公司)； p-Smad7 和 Smad7 一 抗 ( ab227309 和ab226872, 英 國 Abcam 公 司)； TNF-α 一 抗(ab215188,英國Abcam 公司)；IL-6 一抗(1 ∶1000,ab233706,英 國 Abcam 公 司)； Collagen I 一 抗(ab138492, 英 國 Abcam 公 司)； α-SMA 一 抗(ab265588,英 國Abcam 公 司)；NF-κBp65 一 抗(ab183559,英國Abcam 公司)；p-IκBα 一抗(sc-8404,美國Santa Cruz Biotechnology 公司)；GAPDH一抗(ab8245,英國Abcam 公司)；辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔IgG(ab205718,英國Abcam 公司)。

1.3 實驗方法

1.3.1 心肌梗死后心力衰竭動物模型

結扎左前降支冠狀動脈(LAD)后由心肌梗死誘發(fā)心力衰竭。 腹膜內(nèi)注射1%戊巴比妥鈉(50mg/kg)麻醉大鼠,然后進行氣管插管并連接呼吸機正壓通氣,術前記錄12 導聯(lián)心電圖。 皮膚消毒后于胸腔開口,于左心耳根部下方2 mm 結扎LAD。 假手術組的大鼠在不結扎LAD 的情況下進行相同的手術操作。 實驗后記錄十二導聯(lián)心電圖。 將大鼠正常喂養(yǎng)1 周。 根據(jù)經(jīng)胸超聲心動圖檢查結果,當LVEF 降低45%時表示心力衰竭模型建模成功。

1.3.2 動物分組及給藥

將存活大鼠隨機分為以下組:假手術組(n=15)、模型組(n=15)和沙庫巴曲纈沙坦組(n=15)。沙庫巴曲纈沙坦組大鼠每天一次通過管飼法給予沙庫巴曲纈沙坦10 mg/kg。 共治療4 周。 模型組和假手術組給予等體積的生理鹽水。

1.3.3 經(jīng)胸超聲心動圖檢查

采用無創(chuàng)經(jīng)胸超聲心動圖方法評估左心室的形態(tài)和功能。 在麻醉動物中進行超聲心動圖檢查。記錄左心室收縮末期內(nèi)徑(LVIDs)和左心室舒張末期內(nèi)徑(LVIDd)以及左心室射血分數(shù)(EF)和左心室縮短分數(shù)(FS)。

1.3.4 心肌纖維化的測量

給藥4 周后,收集大鼠心臟,并在磷酸鹽緩沖液中洗滌,在4%多聚甲醛中固定過夜,然后包埋在石蠟中。 將每個石蠟包埋的心臟切成4 μm 厚的切片,并用MASSON 三色染色劑染色。 每個切片在尼康顯微鏡下成像,通過Image J 軟件計算纖維化程度。

1.3.5 免疫組織化學染色

通過免疫組織化學染色檢測α-SMA 蛋白的表達。 將心臟組織切片放在烤箱中烤片20 min,然后二甲苯脫蠟,梯度乙醇水化。 使用PH 9.0 的Tris/EDTA 緩沖液進行抗原修復。 在3% H2O2中孵育10 min 來封閉內(nèi)源性過氧化物酶。 將切片在1%PBS 中洗滌3 次,每次6 min,并在4℃下與1%牛血清白蛋白中的一抗(1 ∶500 稀釋)一起孵育過夜。 將切片用1% PBS 洗滌3 次,每次6 min。 然后將切片與HRP-聚合物標記的抗兔IgG 二抗(1 ∶500 稀釋)室溫孵育1 h。 將切片再次用1%PBS 洗滌3 次,每次6 min,然后用蘇木精復染30 s。 使用OLYMPUS BX 50 數(shù)字顯微鏡。 在×400 放大倍數(shù)下觀察圖像。隨機選擇5 個視野進行陽性染色評分,陽性染色評分=陽性細胞計數(shù)評分×染色強度評分。 陽性細胞計數(shù)評分如下:＜5%為0 分,5 ～25%為1 分,5 ～25%為1 分,26～50%為2 分,51～75%為3 分,＞75%為4分。 染色強度評分如下:未染色為0 分,淺黃色為1分,棕黃色為2 分,深棕色為3 分。

1.3.6 蛋白質印跡分析

給藥4 周后,對所有動物實施安樂死,立即收獲心臟并保存在液氮中。 使用RIPA 裂解緩沖液裂解組織。 通過BCA 法測定蛋白質濃度。 蛋白質通過10% SDS-PAGE 分離并轉移到硝酸纖維素膜上,然后與以下一抗在4℃下過夜孵育:TGF-β1(1 ∶500)、p-Smad3 和Smad3(1 ∶500)、p-Smad7 和Smad7(1 ∶500)、TNF-α(1 ∶1000)、IL-6(1 ∶1000)、Collagen I(1 ∶1000)、αSMA(1 ∶500)、NF-κBp65(1 ∶1000)、p-IκBα(1 ∶1000)和GAPDH(1 ∶1000)。 將膜與辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔IgG(1 ∶2000)在室溫下孵育2h。 GAPDH 作為內(nèi)部對照。 通過ECL 法顯影并使用Gene Gnome 凝膠成像系統(tǒng)捕獲生成的圖像。

1.4 統(tǒng)計學方法

2 結果

2.1 沙庫巴曲纈沙坦改善心力衰竭大鼠心臟結構和功能

通過超聲心動圖評估心力衰竭大鼠治療后的心臟功能。 研究顯示(圖1),與假手術組相比,模型組大鼠的EF 和FS 顯著降低,而LVIDs 和LVIDd 顯著升高(P＜0.05)。 此外,與模型組相比,沙庫巴曲纈沙坦組的EF 和FS 顯著升高,而LVIDs 和LVIDd顯著降低(P＜0.05)。

2.2 沙庫巴曲纈沙坦減輕心力衰竭大鼠心肌纖維化

間質纖維化是心梗后心臟重塑的主要特征。通過Masson 對間質纖維化進行的三色染色顯示(圖2),與假手術組相比,心肌梗死組的左室壁結扎部分梗死區(qū)域邊界出現(xiàn)明顯的間質纖維化,膠原蛋白染色區(qū)域顯著增加(P＜0.05)。 此外,與模型組相比,沙庫巴曲纈沙坦組的膠原蛋白染色區(qū)域顯著降低(P＜0.05)。

圖3 和圖4 顯示,與假手術組相比,模型組大鼠心臟組織中肌成纖維細胞標志物α-SMA 的表達顯著升高(P＜0.05)。 與模型組相比,沙庫巴曲纈沙坦組α-SMA 的表達顯著降低(P＜0.05)。 α-SMA 陽性的肌成纖維細胞可促進細胞外基質(ECM)的合成。本研究檢測了Collagen I 的表達,這是心臟成纖維細胞產(chǎn)生的主要膠原蛋白亞型。 研究顯示(圖3),與假手術組相比,模型組的Collagen I 表達顯著升高(P＜0.05)。 與模型組相比,沙庫巴曲纈沙坦組Collagen I 的表達顯著降低(P＜0.05)。

注:A-D:依次為EF、FS、LVIDs 和LVIDd；與假手術組比較,*P＜0.05；與模型組比較,#P＜0.05。圖1 各組大鼠的EF、FS、LVIDs 和LVIDdNote. A-D, EF, FS, LVIDs and LVIDd in sequence. Compared with sham group, *P＜0.05. Compared with model group, #P＜0.05.Figure 1 EF, FS, LVIDs and LVIDd of each group of rats

2.3 沙庫巴曲纈沙坦抑制心力衰竭大鼠心肌TGF-β1/ Smad3 信號通路

TGF-β1/ Smad3 信號通過參與調(diào)控心肌梗死后心肌纖維化的原因,本研究顯示(圖5),與假手術組相比,模型組大鼠心臟組織中TGF-β1 的蛋白表達以及Smad3 的磷酸化水平顯著升高,而Smad7 的磷酸化水平顯著降低(P＜0.05)。 與模型組相比,沙庫巴曲纈沙坦組TGF-β1 的蛋白表達以及Smad3 的磷酸化水平顯著降低,而Smad7 的磷酸化水平顯著升高(P＜0.05)。

2.4 沙庫巴曲纈沙坦抑制心力衰竭大鼠細胞因子的表達

細胞因子(TNF-α 和IL-6)的表達在心臟重塑和心力衰竭中起著關鍵作用。 本研究顯示(圖6),與假手術組相比,模型組TNF-α 和IL-6 的蛋白表達顯著升高(P＜0.05)。 與模型組相比,沙庫巴曲纈沙坦組TNF-α 和IL-6 的蛋白表達顯著降低(P＜0.05)。

2.5 沙庫巴曲纈沙坦抑制心力衰竭大鼠心肌NFκB 信號通路

先前的研究表明,促炎細胞因子誘導IκB 的磷酸化和降解,然后誘導NF-κB 從抑制性信號小體中釋放出來,轉移到細胞核并誘導許多基因的轉錄,從而導致炎性因子如TNF-α 和IL-6 的表達。 本研究顯示(圖7),與假手術組相比,模型組NF-κBp65和p-IκBα 的蛋白表達顯著升高(P＜0.05)。 與模型組相比,沙庫巴曲纈沙坦組NF-κBp65 和p-IκBα 的蛋白表達顯著降低(P＜0.05)。

3 討論

心臟重塑是一個復雜的過程,有許多連續(xù)和重疊的生物過程[8]。 在早期階段,心臟重塑是壞死區(qū)域纖維化修復并形成疤痕的結果。 接下來,重塑過程由存活心肌的結構重排所驅動,包括心肌細胞肥大、心肌纖維化以及進行性左心室擴張。 心肌梗死后的心室擴張是心臟衰竭的代償反應之一。 但是,過度擴張會引起心室收縮和舒張功能障礙,從而導致心力衰竭。 預防不良的心室重塑對于降低心肌梗死后心力衰竭的發(fā)病率和死亡率非常重要。 已經(jīng)證實,間質纖維化是心力衰竭后心臟重塑的典型特征,其特征在于細胞外基質(ECM)的過度積累[9]。 Collagen I 和Collagen III 是最豐富的ECM 成分。 在心臟纖維化模型中,Collagen I 比Collagen III表現(xiàn)出更強烈和更長時間的上調(diào)。 活化的成纖維細胞是纖維化心臟中膠原蛋白的主要細胞來源。 α-SMA 表達已被廣泛用作成纖維細胞分化成活化狀態(tài)的肌成纖維細胞的標記物[10]。 在本研究中,我們觀察到心肌梗死后心力衰竭大鼠心臟中Collagen I和α-SMA 蛋白被上調(diào),這兩者均通過沙庫巴曲纈沙坦治療得以抑制,這表明沙庫巴曲纈沙坦可能通過抑制成纖維細胞活化和膠原生成而具有抗纖維化作用。

注:A:Masson 三色染色圖像；B:膠原染色區(qū)域百分比；與假手術組比較,*P＜0.05；與模型組比較,#P＜0.05。圖2 大鼠心臟組織的Masson 三色染色Note, A, Masson three-color staining image. B, Percentage of collagen staining area. Compared with sham group, *P＜0.05.Compared with model group, #P＜0.05.Figure 2 Masson trichrome staining of rat heart tissue

注:A:Collagen I 的蛋白相對表達量；B:α-SMA 的蛋白相對表達量；C:Western blot 代表性條帶；與假手術組比較,*P＜0.05；與模型組比較,#P＜0.05。圖3 Western blot 檢測大鼠心臟組織Collagen I 和α-SMA 的蛋白表達Note. A, Relative protein expression of Collagen I. B, Relative protein expression of α-SMA. C, Representative Western blot bands. Compared with sham group, *P＜0.05. Compared with model group, #P＜0.05.Figure 3 Western blot detection of collagen I and α-SMA protein expression in rat heart tissues

注:A:α-SMA 的免疫組化染色圖像；B:α-SMA 的陽性染色評分；與假手術組比較,*P ＜0.05；與模型組比較,#P＜0.05。圖4 大鼠心臟組織α-SMA 的免疫組化染色Note. A, immunohistochemical staining image of α-SMA. B, positive staining score of α-SMA. Compared with sham group, *P＜0.05. Compared with model group, #P＜0.05.Figure 4 Immunohistochemical staining of α-SMA in rat heart tissue

注:A:TGF-β1 的蛋白相對表達量；B:Smad3 的磷酸化水平； C:Smad7 的磷酸化水平；D:Western blot 代表性條帶；與假手術組比較,*P＜0.05；與模型組比較,#P＜0.05。圖5 Western blot 檢測大鼠心臟組織TGF-β1 的蛋白表達以及Smad3 和Smad7 的磷酸化Note. A, Relative protein expression of TGF-β1. B, hosphorylation levels of Smad3. C, Phosphorylation levels of Smad7.D, Representative Western blot bands. Compared with sham group, *P＜0.05. Compared with model group, #P＜0.05.Figure 5 Western blot detection of TGF-β1 protein expression and phosphorylation of Smad3 and Smad7 in rat heart tissues

注:A:TNF-α 的蛋白相對表達量；B:IL-6 的蛋白相對表達量；C:Western blot 代表性條帶；與假手術組比較,*P＜0.05；與模型組比較,#P＜0.05。圖6 Western blot 檢測大鼠心臟組織TNF-α 和IL-6 的蛋白表達Note. A, Relative protein expression of TNF-α. B, Relative protein expression of IL-6. C, Representative Western blot bands. Compared with sham group, *P＜0.05. Compared with model group, #P＜0.05.Figure 6 Western blot detection of TNF-α and IL-6 protein expression in rat heart tissues

注:A:NF-κBp65 的蛋白相對表達量；B:p-IκBα 的蛋白相對表達量；C:Western blot 代表性條帶；與假手術組比較,*P＜0.05；與模型組比較,#P＜0.05。圖7 Western blot 檢測大鼠心臟組織NF-κBp65 和p-IκBα 的蛋白表達Note. A, Relative protein expression of NF-κBp65. B,Relative protein expression of p-IκBα. C,Representative Western blot bands. Compared with sham group, *P＜0.05. Compared with model group,#P＜0.05.Figure 7 Western blot detection of NF-κBp65 and p-IκBα protein expression in rat heart tissues

TGF-β1 是一種局部產(chǎn)生的細胞因子,也是組織纖維炎性變化的主要刺激因子。 在心肌梗死后的大鼠心臟中觀察到TGF-β1 明顯高表達,它與成纖維細胞向成肌纖維細胞的轉化以及典型的Smad 信號通路的激活有關[11]。 作為TGF-β1 的主要下游信號轉導子,Smad3 可被激活的TGF-β1 的I 型受體磷酸化,然后與Smad4 形成復合物并易位進入細胞核,在其中它作為轉錄因子并促進靶基因的表達,包括Collagen I 和Collagen III。 有研究表明,TGF-β的大多數(shù)促纖維化活性是由Smad3 介導的[12-13]。Smad7 是一種抑制性Smad 蛋白,能夠與Smad3 和TGF-β 受體復合物TGF-βRI 結合競爭,從而阻止隨后的信號傳導過程。 外源性Smad7 的高表達可以抑制Smad3 的磷酸化[14]。 在本研究中,沙庫巴曲纈沙坦均抑制了心力衰竭大鼠心臟中的TGF-β1/ psmad3 信號通路和下游Collagen I 的表達。 同時,在經(jīng)沙庫巴曲纈沙坦治療的心力衰竭大鼠中,α-SMA表達水平受到抑制。 而p-smad7 表達上調(diào)。 這些結果表明,沙庫巴曲纈沙坦通過上調(diào)Smad7 的蛋白表達來抑制TGF-β1/ Smad3 的信號通路,并進一步抑制成肌纖維細胞的增殖和Collagen I 的上調(diào)。

盡管促炎性細胞因子的表達可能與心肌梗死后的傷口愈合有關,但即使在非梗死的心肌中,細胞因子的過表達也會損害心臟組織并引起纖維化成分的過量沉積。 NF-κB 信號通路是炎癥的“主要調(diào)控者”。 它主要存在于與其抑制劑IκB 蛋白結合的胞質溶膠中。 受細胞因子或其他誘導物刺激后,IκB 蛋白被IκB 激酶降解。 IκB 降解后,NF-κB 易位至細胞核,并與促炎基因調(diào)控區(qū)域κB 位點的DNA結合并促進其轉錄[15-16]。 活化的NF-κB 會增加TGF-β1、TNF-α、IL-6 和IL-1β 的表達,從而激活膠原蛋白沉積和心肌纖維化,導致心肌重塑[17-20]。NF-κB 在細胞因子和纖維化因子的協(xié)同反式激活中起著關鍵作用,這些因子與心力衰竭后法心肌損傷有關。 在本研究中,沙庫巴曲纈沙坦抑制了心力衰竭大鼠心臟中的NF-κBp65、p-IκB 和下游TGF-β1、TNF-α 和IL-6 的表達。 這些結果表明,沙庫巴曲纈沙坦至少部分通過抑制IκB 磷酸化來抑制NF-κB的信號通路并進一步抑制促炎細胞因子的表達。

總之,本研究發(fā)現(xiàn)沙庫巴曲纈沙坦可預防心力衰竭過程總的心臟重塑。 潛在的機制可能與沙庫巴曲纈沙坦對心肌的抗纖維化和抗炎作用有關。沙庫巴曲纈沙坦通過抑制膠原蛋白的產(chǎn)生、心臟成纖維細胞的活化和成纖維細胞的形成有效地減輕了心肌纖維化。 沙庫巴曲纈沙坦主要通過抑制TGF-β1/ Smad3 信號傳導途徑來發(fā)揮其抗纖維化作用。 另外,沙庫巴曲纈沙坦可通過抑制NF-κB 信號傳導從而抑制促炎性細胞因子的過度表達。