基于文獻數(shù)據(jù)庫的慢性不可預(yù)見性溫和應(yīng)激誘發(fā)抑郁癥動物模型研究

李杉杉劉新民*王 瓊

(1.西南醫(yī)科大學(xué)附屬中醫(yī)醫(yī)院中葡中醫(yī)藥國際合作中心/藥學(xué)院,四川 瀘州 646000； 2.中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院藥用植物研究所,北京 100193； 3.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所,北京 100193)

抑郁癥是一種復(fù)雜的疾病,臨床表現(xiàn)為多系統(tǒng)損傷癥狀,涉及多種身心癥狀[1],嚴(yán)重影響患者的健康。 而高達三分之一的抑郁癥患者對傳統(tǒng)抗抑郁藥[2]反應(yīng)不良。 因此,迫切需要開發(fā)更安全、更有效的抑郁癥治療方法,而動物模型是進行發(fā)病機制研究及藥物開發(fā)的基礎(chǔ)手段。

慢性不可預(yù)見性溫和應(yīng)激(chronic unpredicted mild stress, CUMS)模型是常見的研究抑郁癥的模型,其理論依據(jù)為動物處于不適宜生存的環(huán)境時會出現(xiàn)緊張、焦慮和抑郁等癥狀,而長期、慢性、不可預(yù)計的刺激可以加快抑郁癥的發(fā)展。 最初的形式是慢性不可預(yù)見性應(yīng)激(chronic unpredicted stress,CUS),由Katz 等[3]在20 世紀(jì)80 年代初對此模型進行了一系列研究,后來Willner 等[4]在此基礎(chǔ)上發(fā)展了慢性不可預(yù)見性溫和應(yīng)激模型(CUMS)。CUMS 抑郁模型具有高度的有效性,并可持續(xù)幾個月,基本符合抑郁模型的要求,是目前國內(nèi)外文獻中廣泛使用的模型[5-6]。 在臨床前研究中也得到了廣泛的應(yīng)用,有良好的表現(xiàn)、結(jié)果和預(yù)測效度,具有模擬病因的有效性。 本文通過查閱CNKI 和PubMed 兩大常用數(shù)據(jù)庫的相關(guān)文獻資料,對10 年來慢性不可預(yù)見性溫和應(yīng)激進行了歸納和整理,從造模動物、CUMS 模型刺激因子、造模時長等方面進行總結(jié),為CUMS 模型在抑郁癥研究中的使用提供參考。

1 材料和方法

1.1 實驗材料

使用CNKI 和PubMed 兩大常用數(shù)據(jù)庫進行文獻檢索。

1.2 實驗方法

CUMS 相關(guān)文章發(fā)表的研究調(diào)查利用CNKI 的中國學(xué)術(shù)文獻網(wǎng)絡(luò)出版總庫進行文獻檢索。 點擊“高級搜索”,在“主題搜索”中輸入“CUMS”,同時應(yīng)用“并含”輸入“大鼠”,時間設(shè)定為2010 年1 月1日-2020 年4 月30 日,檢索有關(guān)大鼠慢性不可預(yù)見性溫和應(yīng)激方面的中文文獻；同樣的在“主題搜索”中輸入“CUMS”,同時應(yīng)用“并含”輸入“小鼠”,檢索有關(guān)小鼠慢性不可預(yù)見性溫和應(yīng)激方面的中文文獻。 用PubMed 以“CUMS”為關(guān)鍵詞進行文獻檢索,檢索同樣時間段的慢性不可預(yù)見性溫和應(yīng)激相關(guān)的英文文獻。 當(dāng)研究符合以下納入標(biāo)準(zhǔn)時被計為有效文獻:(1)以原始文章的形式發(fā)表的期刊,會議文章、綜述剔除；(2)實驗中有空白組和模型組,并且模型組只使用了CUMS 模型；(3)造模時長以及刺激因子描述完整；(4)使用了行為學(xué)檢測,并且有行為學(xué)結(jié)果；(5)動物品系、雌雄描述清楚,使用未轉(zhuǎn)基因或未接受產(chǎn)前應(yīng)激或絕育的嚙齒動物。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

通過匯總所有納入研究的文獻,全文閱讀審查所要研究的數(shù)據(jù),統(tǒng)計相關(guān)的文獻數(shù)并計算占比。圖形由GraphPad Prism 5, GraphPad Software 提供。

2 結(jié)果

2.1 CUMS 相關(guān)文獻發(fā)表情況

獲得CUMS 相關(guān)的中英文文獻共有1755 篇,其中有關(guān)慢性不可預(yù)見性溫和應(yīng)激方面的中文文獻共有1076 篇(大鼠788 篇,小鼠288 篇),有關(guān)慢性不可預(yù)見性溫和應(yīng)激相關(guān)的英文文獻共有679 篇。對這1755 篇論文進行全文評估后,發(fā)現(xiàn)有效文獻共有679 篇,其中英文文獻有424 篇,中文文獻有255篇。 有效文獻中CUMS 大鼠模型492 篇,CUMS 小鼠模型187 篇。 有效文獻中進行藥效學(xué)研究的有420 篇,其中CUMS 大鼠模型292 篇,CUMS 小鼠模型128 篇。 具體分布情況如圖1。 可見每年發(fā)表文獻逐年上升,其中2018 年及2019 年發(fā)表文獻最多。

2.2 CUMS 模型建立的調(diào)查結(jié)果

2.2.1 CUMS 模型動物的選擇

從圖2A 可見,95.3%的CUMS 造模都選擇雄性鼠。 有文獻報道雄性大鼠對慢性應(yīng)激更敏感[7],但也有文獻認(rèn)為慢性應(yīng)激更易致雌性大鼠產(chǎn)生抑郁樣行為[8],同時還有文獻報道慢性應(yīng)激對不同性別的大鼠所致的抑郁樣行為沒有差異[9]。

關(guān)于大小鼠的選擇,84.4%的研究選擇了大鼠,選擇小鼠的只有15.6%。 對于大鼠,除了個別實驗使用到Charles-Foster、Long-Evans 和GK 大鼠,大部分使用了SD、Wistar 大鼠(圖2B),而有文獻稱Wistar 大鼠較SD 大鼠更敏感[10]。 對于小鼠,除了個別實驗使用到NMRI 和CD-1 小鼠,大部分使用了C57BL/6、昆明、ICR、BALB/c、Swiss 小鼠(圖2C)。其中,BALB/c 小鼠屬于敏感小鼠,C57BL/6 屬于不敏感小鼠[10]。

2.2.2 CUMS 刺激因子的選擇與使用情況

在CUMS 造模過程中,刺激因子的多變性、不可預(yù)見性是模型成功的關(guān)鍵,單獨使用一種刺激不能產(chǎn)生理想的效果,每種刺激因子應(yīng)間隔3 ～7 d[11]。具體的CUMS 造模中刺激因子及其使用情況如圖3所示。

圖1 CUMS 相關(guān)文獻按年份的分布情況Figure 1 Distribution of CUMS related literature by year

從圖3A 可見,68.5%的CUMS 造模過程都選擇了7～9 種刺激因子,只有少數(shù)實驗選擇了≥12 或≤6 種的刺激因子,最少的用了5 種[12],最多的用了15 種[13]。

從圖3B 可見,使用頻率排前十的刺激因子依次為禁水、禁食、潮濕墊料、冰水游泳、籠傾斜、夾尾、束縛、晝夜顛倒、持續(xù)照明、水平振蕩。 大小鼠使用頻率排前十的刺激因子是一樣的,只是排序有差異。 圖3B 羅列的是使用頻率大于10%的刺激因子,圖3C 羅列的是使用頻率小于10%的刺激因子。除此之外,還有部分少見的刺激因子,如腹腔注射生理鹽水、從高處落下、高臺刺激、白光照射、交換鼠籠、強光照射等。

(1)飲食和飲水供應(yīng)的調(diào)整

禁食、禁水是最常見的刺激因子,因其操作簡單而刺激強度較大。 實驗中的禁食有三種類型:單獨禁食(77.6%)、禁食禁水同時進行(20.7%)、禁食后限制進食(1.7%)；禁水也有三種類型:單獨禁水(75.4%)、禁食禁水同時進行(20.5%)、禁水后空瓶(4.1%)。 禁食的刺激時長85.5%為24 h[14],8.1%為12 h[13],8.1%為48 h[15]。 禁水的刺激時長80.5%為24 h[14],8.2%為12 h[15],值得注意的是禁水與潮濕墊料一般不同時進行,因為潮濕墊料中有水。 禁食禁水的刺激時長一般為24 h[16],而禁食禁水后控制飲食時長一般為禁食或禁水23 h 后限制進食或空瓶1 h[17]。 空瓶刺激是一種將水倒掉只留瓶子在鼠籠上的一種應(yīng)激方式,在使動物體感饑渴的同時,更能使動物焦慮,約80%的刺激時長為1 h[18]。

注:A:動物性別使用占比；B:大鼠品系使用占比；C:小鼠品系使用占比。圖2 CUMS 模型中動物的性別、品系使用情況Note. A, The usage proportion of animal sex, B, The usage proportion of rat strain, C, The usage proportion of mouse strain.Figure 2 The usage of animal sex and strain in CUMS model

(2)居住環(huán)境的改變

居住環(huán)境改變常見的有配對、擁擠、鼠籠傾斜、潮濕墊料,少見的有單籠飼養(yǎng)[17]和空籠[14]。 在配對或擁擠刺激中,常見的是將兩只原本單籠飼養(yǎng)的動物放置在同一個鼠籠中,也有實驗者將多于2 只動物放置在一個籠子,刺激時長一般為12 h[19]或24 h[13]。 鼠籠傾斜的角度一般為45°,也有少數(shù)實驗中選擇30°[20]或60°[21]。 對于傾斜45°而言,刺激時長多數(shù)為24 h[14],少數(shù)為12 h[17]。 潮濕墊料的一般操作方式為,將200 mL 水倒入裝有100 g 墊料的鼠籠中,約60%的刺激時長為24 h[13],少數(shù)為12 h[19]。 另外,籠傾斜與潮濕墊料常被運用到同一個實驗內(nèi),有時甚至同時應(yīng)用[22]。

注:A:CUMS 模型中刺激因子使用量；B:常見的刺激因子(使用頻率10%～100%)；C:常見的刺激因子(使用頻率1%～10%)。圖3 CUMS 模型中刺激因子的使用情況Note. A, The number of stimulating factors in CUMS model. B, Popular stimulation factors (frequency 10%～100%). C, Popular stimulation factors(frequency 1%～10%).Figure 3 Usage of stimulating factors in CUMS model

(3)晝夜節(jié)律的重新調(diào)整及光照性質(zhì)改變

常見的有晝夜顛倒、持續(xù)照明、頻閃,少見的有間歇光照、黑暗應(yīng)激[20]和白光照射[20]。 頻閃頻率一般為60 ～150 次/分[17],時長一般為12 h[23]并且在夜間進行。 晝夜顛倒操作即為白天關(guān)燈12 h,夜晚開燈12 h[14]。 持續(xù)照明多數(shù)為通宵持續(xù)照明[16]。 間歇照明較少見,一般持續(xù)10 ～24 h,大部分是以2～3 h 為一個循環(huán)[23],少數(shù)是以1 h 為一個循環(huán)[13]。

(4)游泳

游泳一般有冷水游泳,熱水游泳,強迫游泳三種應(yīng)激方式。 冷水游泳主要是使實驗鼠接受冷的刺激,大部分為在4℃～6℃的水中游泳5 min[13]。熱水游泳主要是使實驗鼠接受熱的刺激,大部分為在40℃～45℃的水中游泳5 min[13]。 而單純的強迫游泳主要是使動物疲勞,一般為在20℃～25℃[24]水中游泳幾分鐘至1 h 不等。 實驗中常用的應(yīng)激因子是前兩種。

(5)溫度調(diào)整

溫度變化一般分為高溫刺激或低溫刺激。 高溫環(huán)境刺激是將實驗鼠移至溫度比較高的房間或烘箱中,溫度一般為42℃～50℃,刺激時長一般為5～15 min[19]。 值得注意的是高溫環(huán)境刺激與熱水游泳一般不在實驗中同時出現(xiàn)。 低溫刺激即將房間溫度調(diào)至0℃～5℃,刺激時間一般為1～2 h[19]。

(6)其余應(yīng)激方式

夾尾是將夾子夾在實驗鼠尾巴上使其疼痛的一種應(yīng)激方式,多數(shù)實驗選擇夾在距離尾根1 cm處,應(yīng)激時長一般為1 ～3 min[16]。 束縛是限制動物活動的一種應(yīng)激方式。 應(yīng)激時長一般為1 ～6 h,44.2%的實驗束縛2 h[14]。 水平振蕩是將動物放置在鼠籠中,使用手動或機器的方式使其在水平面高速振蕩的一種應(yīng)激方式。 刺激時間多為5 ～15 min,頻率在60～160 rpm 之間[14-15]。 噪音干擾一般有4種:捕食者聲音,一般使用時間為30 min[25]；超聲[26]應(yīng)激時長為1～24 h 不等；白色噪音,分貝一般在60～120 dB[17],使用時間一般為1 ～12 h；以及實驗鼠尖叫聲[20]。 前三者較常見,而最后一種刺激少見。 電擊常用短時間電擊足底[26]、少數(shù)采用電擊耳朵[22]。 常用的強度為1 ～15 mA,60 ～70 V,一般每次電擊5～10 s,間隔10～50 s,共15～30 次。 陌生異常物體如塑料杯、勺子、碎布片等在鼠籠中放置,會使動物產(chǎn)生焦慮和恐懼,應(yīng)激時長一般為24 h[24]。懸尾刺激是使動物處于倒懸位的一種刺激方式,應(yīng)激時長一般為1 ～5 min[24]。 氣味刺激的應(yīng)激時長一般為1～3 h[16,27]。

2.2.3 CUMS 造模時長及每日刺激次數(shù)的使用情況

如圖4A 所示,造模3～4 周占大部分(58.8%),造模時間最短為11 d,每天給予2 種刺激因子[28],造模時間最長為14 周,每天給予一種刺激因子[29],還有少數(shù)為分段造模[18]。 從圖4B 可見,95.5%的CUMS 造模過程,每天都只安排1 ～2 種刺激因子[23],少數(shù)實驗者采用每天3 ～4 種刺激因子[19]。造模時長為3 ～4 周的實驗中,81.8%每天給予1 種刺激因子,2.6%每天給予3 ～4 種刺激因子；造模時長為5～8 周的實驗中,60.5%每天給予1 種刺激因子,9.2%每天給予3～4 種刺激因子。

對于造模后,研究抑郁狀態(tài)的持續(xù)時長的文章,統(tǒng)計發(fā)現(xiàn)共有66 篇。 其中研究造模3 周后抑郁持續(xù)時間的文章最多,共31 篇,4 周的次之,有20篇。 給予刺激因子3～4 周后,撤出刺激因子后抑郁可以持續(xù)3 ～4 周[14,30],有些甚至持續(xù)5 周[31]。 可見撤出刺激因子后抑郁狀態(tài)持續(xù)時長可與刺激時長持平,甚至長于刺激時長。

2.3 CUMS 行為學(xué)檢測的研究調(diào)查

圖5 是大小鼠都會使用到的行為學(xué)檢測的使用頻次排序。 我們可以看出,在實驗中用到糖水偏好實驗(SPT)的頻率最高,其次有曠場實驗(OFT)、強迫游泳實驗(FST)、懸尾實驗(TST)、水迷宮實驗(MWM)、高架十字迷宮實驗(EPM)、新奇抑制攝食實驗(NSFT)等行為學(xué)檢測。 除此之外,少數(shù)小鼠用到輻射臂迷宮實驗、嗅覺鑒別實驗、嗅覺靈敏度實驗、巴恩斯迷宮、高架零迷宮測驗、社會交互實驗等行為學(xué)測試。 少數(shù)大鼠用到機械痛覺過敏實驗、熱痛覺過敏實驗、被動回避實驗、熱板實驗、跳臺實驗等行為學(xué)測試。

注:A:CUMS 造模時長分布圖；B:每日刺激數(shù)使用占比。圖4 CUMS 模型中造模強度使用情況Note. A, Distribution of modeling duration in CUMS model, B, Usage proportion of daily stimulating factors.Figure 4 Usage of modeling strength in CUMS model

圖5 CUMS 模型中行為學(xué)測試使用頻率分布圖Figure 5 Frequency distribution of behavioral tests in CUMS model

CUMS 抑郁模型主要模擬了人類抑郁的核心癥狀——快感缺失。 統(tǒng)計發(fā)現(xiàn)在大小鼠中最常用的行為學(xué)檢測都是糖水偏好實驗,糖水偏愛指數(shù)作為測量CUMS 抑郁模型快感缺乏的有效客觀指標(biāo)。 強迫游泳實驗和懸尾實驗既是應(yīng)激性抑郁動物模型的造模方法,也是抑郁動物模型常用的檢測方法；而曠場實驗可用于評價各類應(yīng)激性抑郁動物模型的自主運動行為、探究行為和緊張度,從而反映抑郁程度。 此4 種行為學(xué)檢測使用頻率都大于10%。值得注意的是懸尾實驗共使用了141 次,其中小鼠108 次(在小鼠中使用頻率為57.8%)、大鼠33 次(在大鼠中使用頻率為6.7%)。 而運用到強迫游泳實驗的實驗中,只有3.0%使用到了強迫游泳這種刺激因素。 CUMS 不僅可以導(dǎo)致抑郁,也可導(dǎo)致認(rèn)知障礙與焦慮,所以部分實驗也用到了水迷宮實驗與高架十字迷宮實驗。

不同的行為學(xué)檢測出現(xiàn)顯著性差異的時間不同。 糖水偏愛實驗[32]和曠場實驗[32]最早為1 周,強迫游泳實驗[33]、懸尾實驗[33]與高架十字迷宮實驗[34]最早為2 周,水迷宮實驗[19]與新奇抑制攝食實驗[25]最早為3 周。

3 討論

長期不良事件刺激與抑郁癥的發(fā)生有明確關(guān)系,且不良事件越多,抑郁癥的發(fā)生率越高[35]。CUMS 模型可以模擬生活中的不同應(yīng)激源,使得動物產(chǎn)生抑郁癥狀,與人類患抑郁癥的歷程有相似性。 本文綜述了造模動物、CUMS 模型刺激因子、造模時長,希望為今后CUMS 造模提供一些參考:(1)雄性大鼠的使用頻率較高,若無特殊要求可以選擇雄性大鼠；(2)為了使動物不可預(yù)知刺激,刺激因子選擇7 ～9 種比較合適,3 ～7 d 內(nèi)不重復(fù),但如果實驗條件允許,也可以選擇更多的刺激因子；(3)幾乎實驗中都會出現(xiàn)禁食禁水、冰水游泳、潮濕墊料、籠傾斜、光照節(jié)律改變,再搭配一些其他刺激因子；(4)建議每天選擇1 ～2 種刺激因子；(5)造模長度選擇3～4 周比較合適,如果是先造模后給藥,可以采用造模與給藥時間等同；(6)大小鼠都可以使用糖水偏好實驗、曠場實驗、強迫游泳實驗,如果是小鼠也可以使用懸尾實驗,而進行認(rèn)知與焦慮方面的研究可以考慮水迷宮實驗、高架十字迷宮實驗。