新生乳鼠側腦室注射rAAV2/9 遞送SNCA 構建全腦轉基因鼠

李國祥潘 玥胡 鵬杜廷福馬開利*

(1.中國醫學科學院&北京協和醫學院醫學生物學研究所 藥物安全性評價研究中心,昆明 650118；2.中國醫學科學院&北京協和醫學院 醫學靈長類研究中心&神經科學中心,北京 100005)

帕金森病(Parkinson,s disease,PD)是第二大常見神經系統退行性疾病,其主要特征是中腦黑質多巴胺能神經元的死亡及α-突觸核蛋白的聚集[1]。然而,α-突觸核蛋白在PD 中確切的功能尚未完全研究清楚。 動物模型無疑是研究蛋白質功能及PD發病機理的一個重要工具,目前迫切地需要一些動物模型去探究α-突觸核蛋白確切的生理功能及進行藥物研發的評估。 盡管已經開發出許多模型,如毒素模型和轉基因動物模型,部分能表現出黑質及紋狀體多巴胺能神經元減少或多巴胺(dopamine,DA)水平降低以及行為障礙[2-6],表明α-突觸核蛋白的積累可以顯著影響DA 能神經元的功能,但在大多數小鼠中都沒有發現明顯的黑質及紋狀體變性[7-9],不能完美地再現PD 的病理特征[10],給PD的研究帶來了困擾。

在最近的研究中,有學者嘗試用rAAV 在成年鼠中以腦立體定位注射的方式構建α-突觸核蛋白局部過表達動物模型,能初步重現PD 的原發性運動障礙及部分多巴胺能神經元損傷[11-14],表明rAAV 可以作為一種快速靶向的動物模型建立的工具,然而靶向和局部α-突觸核蛋白過表達有一定的局限性,局部注射的rAAV 只在部分腦區傳導表達,而PD 的發生發展可能由多個腦區的共同參與。 最近研究表明,可以通過向胎鼠或乳鼠腦室內注射rAAV 來實現整個中樞神經系統的基因表達[15-18],與成年鼠注射病毒相比,這種方法可實現更有效的擴散和感染,且表達在注射后數天內開始,并持續于動物的整個生命周期[19-21]。 且有報道稱rAAV2/9 能跨越血腦屏障,表現出在中樞神經系統廣泛傳導的能力[22],并能感染新生神經元[21,23]。 此外,人源SNCA(hSNCA)轉基因小鼠模型已經被廣泛應用和認可,人源α-突觸核蛋白在小鼠中并不會引起強烈的免疫排斥反應而被清除,可長期表達存在[5-6,24]。 因此,本文旨在通過對新生乳鼠ICV 注射攜帶人源的SNCA-EGFP基因或EGFP的rAAV2/9,快速高效地構建腦中廣泛表達α-突觸核蛋白的轉基因模型,并初步探究α-突觸核蛋白過表達對小鼠腦的影響。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

SPF 級C57BL/6 小鼠30 只,8 周齡,體重20 ～22 g,雌雄2 ∶1,由中國醫學科學院醫學生物學研究所小動物部提供[SCXK(滇)K2019-0002]。 動物飼養在中國醫學科學院醫學生物學研究所藥物安全性評價研究中心20℃～24℃的屏障環境中[SYXK(滇)K2018-0006],自由進水和進食,采用晝夜12 h 間斷照明。 在實驗前以雌雄2 ∶1的比例合籠,見栓后把母鼠分離單獨飼養。 給予充足的食物和水源,在母鼠妊娠后第1 天(postnatal day,P0)進行病毒注射并標記后繼續給予充足的食物和水源飼養。 實驗經本單位倫理委員會審核批準(DWSP202012008),實驗過程按實驗動物使用的3R 原則給予動物人道關懷。

1.2 主要試劑與儀器

無內毒素質粒小提取試劑盒( 貨號:CW2106S)、BCA 蛋白定量試劑盒(貨號:CW0014S)購自康為科技有限公司；只與人源α-突觸核蛋白反應的兔多克隆抗體α-synuclein(MJFR1) (貨號:ab138501)、NeuN 鼠單克隆抗體(貨號:ab104224)、DAPI(貨號:ab104139)購自英國abcam；GFAP 鼠單克隆抗體(貨號:Cat# G3893)及固綠(貨號:F7252)購自美國Sigma；Iba 1 兔多克隆抗體(貨號:016-20001)購自日本wako；抗聚集性α-synuclein(5G4)單克隆抗體(貨號:MABN389)購自美國Merck；鼠α-synuclein 單克隆抗體(貨號:610786)購自美國BD；兔來源TH 多克隆抗體(貨號:PA5-85167)購自美國Invitrogen；GAPDH 單克隆抗體(貨號:60004-1)購自美國Proteintech；594 波長免疫熒光兔二抗(貨號:A11012)及488 波長鼠二抗(貨號:A11001)購自美國Invitrogen；Western blot 兔源熒光二抗(貨號:926-32211)及鼠源熒光二抗(貨號:926-32210)購自 美 國 Li-cor； 免 疫 組 化 試 劑 盒( 貨 號:GK5000705)購自上海基因科技；微量注射器購自瑞士Hamilton。

1.3 實驗方法

1.3.1 質粒構建及病毒包裝

pAAV-hSyn-EGFP、 pAAV-hSyn-SNCA-PGK-EGFP質粒由本實驗室構建和保存。 兩種質粒在大腸桿菌中擴增后用質粒小提試劑盒提取質粒DNA 并鑒定。 攜帶人源SNCA-EGFP及EGFP的重組腺相關病毒rAAV2/9 由泰爾圖公司包裝并純化,其病毒滴度約為1.5×1013GC/mL,凍存在-80℃冰箱中待用。

1.3.2 新生乳鼠側腦室注射

在注射前把注射針頭、鑷子和剪刀高壓滅菌。取1.5 μL 病毒與0.5 μL 的固綠混合,充分混勻并置于冰上,固綠用于標記注射位點。 出生后第1 天(P0)的乳鼠與母鼠分離,置于冰上2～3 min 充分麻醉,用5 μL Hamilton 微量注射器注射小鼠側腦室,進針深度為3 mm,注射速度約為1 μL/min,每側注射1 μL,注射后留針1 min。 注射結束時擦拭75%乙醇并標記后放入籠中繼續飼養2 周或3 個月進行解剖檢測。

1.3.3 Western blot

處死小鼠取腦并分離各個腦區置于冰冷的EP管中,加入適量的RIPA 裂解后,取上清用BCA 試劑盒進行蛋白定量,之后加5×上樣緩沖液進行煮沸5 min 待用。 配置SDS-PAGE 膠,上樣,85 V 電壓跑膠120 min 后,用半干轉儀進行轉膜,5%脫脂牛奶室溫封閉45 min 后,抗體孵育4℃過夜,TBS 洗膜5min×3 次后,用羊抗鼠或抗兔的Western blot 熒光二抗室溫孵育1 h,TBST 洗膜3 次后,Odyssey 紅外激光掃描系統進行顯影拍照。

1.3.4 免疫熒光

用多聚甲醛對2 周或3 個月的rAAV2/9 ICV 注射小鼠進行灌注,取腦后用多聚甲醛固定24 ～36 h,脫水機脫水處理,包埋后切片厚度為4 μm。 切好的片子65℃孵箱烤片,常規脫蠟水化,蒸餾水沖洗,PBS 浸泡5 min,Tris-EDTA 緩沖液微波爐煮沸進行抗原修復15 min,蒸餾水浸泡5 min,正常山羊血清室溫封閉1 h 后,滴加相應稀釋好的一抗4℃過夜,PBS 洗5 min×3 次,后滴加鼠或者兔來源的熒光二抗,DAPI 封片后用Panoramic MIDI 獲取圖片。

1.3.5 免疫組化

多聚甲醛對2 周或3 個月的rAAV2/9 ICV 注射小鼠進行灌注,取腦后用甲醛固定24 ～36 h,脫水機脫水處理,包埋后切片厚度為4 μm。 切好的片子65℃孵箱烤片,常規脫蠟水化,蒸餾水沖洗,PBS 浸泡5 min,用Tris-EDTA 緩沖液微波爐煮沸進行抗原修復15 min,蒸餾水浸泡5 min,3%過氧化氫孵育30min 去除內源性過氧化氫酶,正常山羊血清室溫封閉1 h 后,滴加抗α-synuclein(MJFR1)兔多克隆抗體及Iba 1 兔多克隆抗體,4℃過夜。 PBS 洗5 min×3 次,滴加辣根過氧化物酶標記的二抗,室溫孵育1.5 h,PBS 洗5 min×3 次,新鮮配置的DAB 顯色液。蘇木素復染3 min,鹽酸乙醇脫色,氨水返藍,梯度乙醇及二甲苯脫水,樹膠封片,用Panoramic MIDI 獲取圖片。

2 結果

2.1 新生乳鼠側腦室rAAV2/9 注射構建hSNCA轉基因模型

為了高效構建一種hSNCA轉基因鼠模型,我們按照如圖1A 上所示方法對新生乳鼠側腦室注射rAAV2/9。 在注射后,病毒擴散到各個腦室中(圖1 A 下),表明注射位點是準確的。 兩周后,用只與人源α-突觸核蛋白反應的Anti-α-synuclein(MJFR1)抗體進行免疫熒光染色檢測α-突觸核蛋白在整個腦區的表達水平。 結果如圖1B 所示,在對照組AAV-EGFP 中,未出現α-突觸核蛋白陽性染色,表明抗體的特異性良好,不會與鼠源α-突觸核蛋白發生交叉反應,而在實驗組AAV-SNCA 中,檢測到α-突觸核蛋白廣泛表達在轉基因鼠的各個腦區。 為了驗證這個結果,采用Western blot 分別檢測2 周(圖1C)及3 個月(圖1D)年齡的鼠嗅球(olfactory bulb, OB)、 皮 層(cerebral cortex, CTX)、 海 馬(hippocampus, hip)、 間 腦(interbrain, IB), 中 腦(middle brain,Mid),小腦(cerebellum,CB),后腦(hindbrain,HB)中α-突觸核蛋白的表達,結果顯示α-突觸核蛋白在各個腦區中均表達,其中在小腦中表達量稍低,與免疫熒光結果一致。 這些結果表明轉基因鼠構建成功,且α-突觸核蛋白廣泛持久地表達(2 周～3 個月),人源α-突觸核蛋白并未發生強烈的免疫排斥反應而被清除。

2.2 ICV 注射rAAV2/9 后α-突觸核蛋白在全腦廣泛表達

為了進一步探究轉基因鼠中α-突觸核蛋白的表達模式,用α-突觸核蛋白特異性抗體的免疫組織化學染色檢測2 周齡鼠嗅球(olfactory bulb,OB)、皮層(cerebral cortex,CTX)、海馬(hippocampus,Hip)、間腦(interbrain,IB)、中腦(middle brain,Mid)和小腦(cerebellum,CB)中α-突觸核蛋白的表達。 結果顯示,α-突觸核蛋白在嗅球中高表達(圖2A),少部分分布在胞核中。 在大腦皮層處(圖2B),α-突觸核蛋白高表達并主要分布在胞質中,而在海馬的CA2/3 區(圖2C),α-突觸核蛋白廣泛分布在顆粒細胞層的胞質及胞核中。 在間腦中(圖2D),α-突觸核蛋白廣泛分布在丘腦及下丘腦中。 在中腦(圖2E)中,α-突觸核蛋白亦高表達,并主要在胞質中。 有趣的是,α-突觸核蛋白特異性地表達在小腦的浦肯野細胞中(圖2F)。

2.3 ICV 注射rAAV2/9 后α-突觸核蛋白的表達定位

蛋白質的表達定位往往與其特定的功能相關,我們通過免疫熒光檢測2 周齡鼠中人源α-突觸核蛋白的亞細胞定位。 結果顯示,在多巴胺能神經元(TH+神經元)中,α-突觸核蛋白高表達,且其主要表達于神經元胞質中(圖3A)。 在其它腦區,如圖3B所示,嗅球及皮層中有少部分α-突觸核蛋白表達在胞核中,而在海馬的CA2/3 區,少數顆粒細胞的胞核中出現α-突觸核蛋白核定位的現象,在小腦處,α-突觸核蛋白在浦肯野細胞核中高表達,其結果與圖2F 一致。

注:A:新生乳鼠注射方式模式圖；B:2 周齡鼠α-突觸核蛋白的免疫熒光染色；C:Western blot 檢測2 周齡鼠腦中人源及總的α-突觸核蛋白(人+鼠)在對照及轉基因小鼠各個腦區的表達；D:Western blot 檢測3 月齡鼠腦中人源及總的α-突觸核蛋白(人+鼠)在對照及轉基因小鼠各個腦區的表達。 GAPDH 作為內參。圖1 SNCA 轉基因鼠的構建Note. A, Cartoon describes the surgical approach for ICV injection in neonatal mouse brains. B, Immunofluorescence stain reveals the expression of αsynuclein in the whole brain at 2 weeks. C,Level of human and total α-synuclein expression in the transgene was assessed by Western blot at 2 weeks.D, Level of human and total α-synuclein expression in the transgene were assessed by Western blot at 3 months. GAPDH was used as an internal control.Figure 1 Construction of SNCA transgenic mice

2.4 ICV 注射rAAV2/9 后誘導膠質細胞增生

大量的研究表明PD 的發生可能與神經炎癥密切相關。 于是,通過免疫熒光檢測3 月齡轉基因鼠腦中星形膠質細胞的數量(GFAP+細胞),如圖4A所示,在黑質(Substantia nigra,SN)中,α-突觸核蛋白廣泛表達的區域出現星形膠質增生的現象,而在海馬中(圖4B)得到了同樣的結果,GFAP+膠質細胞也顯著地增生。 此外,免疫組化染色檢測的小膠質細胞在海馬(圖4C)及皮層(圖4D)也顯著增生。

注:免疫組化分析2 周齡鼠人源α-突觸核蛋白在各個腦區中的表達。 A:嗅球(OB)；B:皮層(CTX)；C:海馬(Hip)；D:間腦(IB)；E:中腦(Mid)；F:小腦(CB)。 后圖為局部放大圖。圖2 轉基因鼠中α-突觸核蛋白在各個腦區中廣泛表達Note. Level and distribution of human α-synuclein expression were evaluated histologically. A, Olfactory bulb(OB). B, Cerebral cortex(CTX). C,Hippocampus(Hip). D, Interbrain(IB). E, Middle brain(Mid). F, CB Cerebellum(CB). A partial enlarged view is attached after the figure.Figure 2 Widespread α-synuclein expression of the transgene throughout the mice brain

2.5 ICV 注射rAAV2/9 后出現病理性α-突觸核蛋白

在PD 中,第129 位絲氨酸磷酸化(pS129)及聚集形式的α-突觸核蛋白常被檢測到,被認為是PD的標志之一。 在轉基因鼠中,我們通過免疫組化檢測表明,pS129 在3 月齡小鼠嗅球及皮層中(圖5A)均出現,且在嗅球的神經元中強陽性染色。 進一步用抗聚集形式的α-突觸核蛋白單克隆抗體(αsynuclein 5G4)檢測其表達時(圖5B),發現其在嗅球和皮層亦出現陽性染色,表達模式與pS129 一致。

3 討論

rAAV 的研究及廣泛應用,為我們高效地基因傳遞提供了非常快速有效的工具,先前多項研究通過靶向小鼠黑質、紋狀體及嗅球構建α-突觸核蛋白局部過表達小鼠模型,極大地促進人們對PD 發病機理的認識,然而由于靶向定點腦區注射后蛋白質過表達的區域局限性,所以在該研究中,基于rAAV2/9 在神經系統中的高效的傳遞效率[21-22],我們通過新生乳鼠側腦室注射攜帶人源SNCA-EGFP或EGFP的rAAV2/9,構建了全腦人源α-突觸核蛋白高表達的轉基因鼠。 在注射rAAV2/9 后立即解剖乳鼠腦,發現固綠染色的病毒液在大腦各腦室之間擴散,表明注射位點的準確性。 前期的研究表明注射的時間點影響注射效率[15],于是在本實驗中嚴格控制注射時間在出生后12 個小時之內。

在小鼠成長到2 周或3 個月后,用免疫熒光和Western blot 實驗檢測到了2 周及3 個月齡α-突觸核蛋白在全腦中廣泛的表達(圖1 所示),這表明通過乳鼠側腦室注射的方式在注射后早期α-突觸核蛋白便能高表達,提示可以用此模型探究α-突觸核蛋白在小鼠出生后腦發育過程中的作用。 此外,Western blot、免疫熒光及免疫組化實驗表明,α-突觸核蛋白趨向于在小鼠嗅球、皮層、海馬、間腦及中腦中高表達,而在小腦中表達量稍低,這可能與病毒感染的細胞偏好性或者α-突觸核蛋白表達的細胞偏好性有關,其具體的機理仍然需要進一步研究。此外,進一步通過免疫熒光探究α-突觸核蛋白的亞細胞定位,發現在嗅球、皮層、海馬及小腦中,α-突觸核蛋白有胞核定位的現象,而之前的研究結果表明,α-突觸核蛋白核易位與細胞毒性相關[25-26],提示這幾個腦區的α-突觸核蛋白可能產生細胞毒性。有趣的是,α-突觸核蛋白在小腦浦肯野細胞中高表達,這提示α-突觸核蛋白可能在小鼠的浦肯野細胞中發揮特定未知的功能。 免疫熒光結果表明,α-突觸核蛋白在多巴胺能神經元中高表達,這為之后研究α-突觸核蛋白參與PD 發生的機理奠定基礎。

注:A:α-突觸核蛋白在中腦黑質(SN)中表達,TH:多巴胺能神經元標志物；B:α-突觸核蛋白在各腦區的表達及定位。圖3 α-突觸核蛋白在轉基因鼠中的表達及亞細胞定位Note. A, α-synuclein is expression in the Substantia Nigra(SN). TH, The marker of dopaminergic neuron. B, Expression and subcellular localization of α-synuclein in different brain regions.Figure 3 Expression and subcellular localization of α-synuclein throughout the whole mice brain

之前的研究認為,星形膠質細胞及小膠質細胞參與的神經炎癥與PD 的發生發展密切相關[27-28],于是我們檢測轉基因小鼠中星形膠質細胞及小膠質細胞的變化,有趣的是,在轉基因小鼠中星形膠質細胞及小膠質細胞嚴重增生,這進一步提示α-突觸核蛋白誘導的神經炎癥可能參與到PD 的發生發展中。 最重要的是,在PD 患者的尸腦組織中,常檢測到α-突觸核蛋白pS129 及聚集的現象[29-31],而在通過rAAV2/9 構建的轉基因鼠的嗅球及皮層中均檢測到pS129 及聚集的現象,且在嗅球處高表達,這提示嗅球及皮層與PD 的發生發展密切相關。

總之,我們成功用攜帶人源SNCA的rAAV2/9構建了α-突觸核蛋白的全腦轉基因鼠,α-突觸核蛋白在整個腦中廣泛表達,并出現了膠質增生及病理性α-突觸核蛋白表達的現象。 該轉基因模型的成功建立,將為探究α-突觸核蛋白的生理作用及其在PD 中的作用提供一定的基礎。

注:A:過表達α-突觸核蛋白引起黑質(SN)的星形膠質細胞增生；B:過表達α-突觸核蛋白引起海馬(Hip)的星形膠質細胞增生；C:過表達α-突觸核蛋白引起海馬(Hip)的小膠質細胞增生；D:過表達α-突觸核蛋白引起皮層(CTX)的小膠質細胞增生。GFAP:星形膠質細胞標志物；Iba 1:小膠質細胞標志物。圖4 α-突觸核蛋白過表達引起膠質細胞增生Note. A, Overexpression of α-synuclein incraese astrogliosis in Substantia nigra. B, Overexpression of α-synuclein incraese astrogliosis in Hippocampus. C, Overexpression of α-synuclein incraese microgliosis in Hippocampus. D, Overexpression of α-synuclein incraese microgliosis in Cerebral cortex. GFAP, The marker of astrocyte. Iba 1, The marker of microglia.Figure 4 Overexpression of α-synuclein associated with astrogliosis and microgliosis

注:A:免疫組化檢測嗅球(OB)和皮層(CTX)中α-突觸核蛋白pS129 的表達分布；B:免疫組化染色檢測嗅球(OB)和皮層(CTX)中聚集形式的α-突觸核蛋白的表達分布。圖5 病理性的α-突觸核蛋白的檢測Note. A, pS129 was detected within the neuronal soma in the olfactory bulb(OB)and cerebral cortex(CTX). B, Aggregated α-synuclein was detected within the neuronal soma in the olfactory bulb(OB)and cerebral cortex(CTX).Figure 5 Detection of α-synuclein-associated pathology