基于網絡藥理學和分子對接技術研究柴胡-黃芩藥對治療鼻竇炎的作用機制

李清韻謝 慧李宇思王 露

(1.成都中醫藥大學,成都 610072； 2.成都中醫藥大學附屬醫院,成都 610075)

鼻竇炎是由于多種因素導致的鼻腔及鼻粘膜的炎癥性疾病[1]。 臨床以鼻塞、流膿涕、頭痛及嗅覺減退為主要癥狀,分為急性和慢性,前者病程短,起病急,頭痛或面痛為甚,伴有發熱,涕中帶血等不適,后者病程長,易復發、纏綿難愈,鼻涕色白粘而量多,同時可伴有精神不振、倦怠乏力、記憶力下降等全身癥狀[2]。 屬于中醫學的“鼻淵”、“頭風”、“腦漏”等范疇。 “鼻淵”最早的記載見于黃帝內經的《素問·氣厥論》,曰:“膽移熱于腦,則辛頞鼻淵。鼻淵者,濁涕下不止也”[3]。 鼻竇炎在各個年齡階段均有產生,在中年及青少年較為多見,兒童也是主要群體[4-5]。 鼻竇炎在我國的患病率約為8%[6],在歐美等其他國家的發病率約為12%[7-8]。 其病因可能包括病原體感染、過敏反應,免疫功能障礙、環境因素、遺傳因素等多種因素[9-12],鼻竇炎嚴重影響了人民的生活質量和工作效率,在國內外都引起了很大的重視與關注。

在東漢張仲景所著的《傷寒論》小柴胡湯中首次記載了柴胡黃芩藥對的配伍[13],小柴胡湯為和解劑,主治傷寒少陽病證,具有和解少陽之功效。 柴胡苦涼而氣輕清,性主升散,善于疏散少陽之邪,開氣分之結,解表而和里；黃芩苦寒,善清氣分之熱,清泄少陽郁火。 二藥配伍,疏散與清泄并施,則少陽之邪,內外分消,樞機因而和暢[14]。 兩者配伍是和解少陽的基本結構。

中醫藥經過幾千年的發展,積累了豐富的臨床經驗,形成了一個完整而獨特的醫學體系。 盡管由于歷史原因,中醫藥的科學基礎有待進一步鞏固,但新的證據已經開始表明中醫藥是醫學再發現的一個重要領域[15]。 中醫網絡藥理學就是建立網絡分子靶點與中醫證候疾病模式之間的聯系[16]。 因此,建立中藥成分-靶向藥物網絡方法,研究中藥、成分、靶點與藥物之間的關系,具有十分重要的意義[17]。 本研究借助網絡藥理學對柴胡-黃芩藥對治療鼻竇炎的作用機制進行了整體研究,為其進一步藥理作用研究和臨床應用提供參考依據。

1 材料和方法

1.1 實驗材料

通過 TCMSP 數據庫(https:/ /tcmspw. com/tcmsp.php)獲取柴胡-黃芩藥對的成分與靶點,根據uniprot(https:/ /www.uniprot.org)數據庫中的靶點信息作為統一標準,從genecard 數據庫(https:/ /www.genecards.org) 獲取鼻竇炎疾病靶點,運用string(https:/ /string-db.org/) 平臺制作蛋白相互作用(PPI)網絡；使用Metascape 平臺(http:/ /metascape.org/)對靶點進行GO 富集分析,DAVID 數據庫(https:/ /david.ncifcrf.gov/)對靶點進行KEGG 富集分析。 利用Cytoscape(版本號:3.8.0)軟件構建網絡圖,從PDB(http:/ /www.rcsb.org)網站獲取分子對接蛋白構象。

1.2 實驗方法

1.2.1 篩選柴胡-黃芩藥對的有效成分及靶點

通過中藥系統藥理數據庫和分析平臺(TCMSP)(http:/ /tcmspw.com/tcmsp.php)收集柴胡和黃芩的所有化學成分,選取口服生物利用度(OB)≥30%和類藥性(DL)≥0.18 為條件篩選活性成分,并收集活性成分的作用靶點。 并用UniProt 數據庫(http:/ /www.uniprot.org/)提取相關靶點基因。

1.2.2 篩選疾病靶點

在Genecards 數據庫(https:/ /www.genecards.org/)中查找,以“Sinusitis”為檢索詞,檢索鼻竇炎相關靶點,建立疾病靶點數據集。 本研究篩選Score≥3 分的基因。

1.2.3 “藥物-成分-靶點”網絡構建

將柴胡-黃芩藥對的靶點基因與疾病的基因取交集,利用在線工具Draw Venn Diagram 繪制韋恩圖。 再將藥物和疾病映射的共同靶點與藥物的有效活性成分運用Cytoscape3.8.0 軟件繪制“藥物-成分-靶點”網絡圖。

1.2.4 構建PPI 及其核心網絡

利用String 平臺(https:/ /string-db.org/)構建PPI 網絡圖。 并利用Cytoscape v3.8.0 軟件的在線工具Network Analyzer 進行參數設置,構建核心網絡。

1.2.5 GO 富集分析與KEGG 通路分析

分別使用DAVID 和metascape 在線平臺對上述獲得的相關核心靶點進行GO 及KEGG 富集分析。運用在線繪圖平臺繪制GO 及KEGG 富集分析的氣泡圖、柱狀圖,再利用Cytoscape 軟件構建“成分-靶點-通路”網絡圖。

1.2.6 分子對接驗證

通過TCMSP 數據庫獲得活性成分mol2 格式化學結構,利用PDB 數據庫(http:/ /www.rcsb.org/)獲取相應的靶點蛋白,然后利用Auto Dock 軟件進行分子對接。

2 結果

2.1 柴胡-黃芩藥對的主要活性化合物及鼻竇炎作用靶點

柴胡-黃芩活性成分靶點通過TCMSP 篩選得到,柴胡化合物13 個,靶點目標348 個,黃芩化合物32 個,靶點目標507 個,篩選出相關化合物44 個(一個重合)、對應的作用靶點225 個(刪除重復),應用Uniprot 數據庫查詢與靶點蛋白相對應的人類基因名稱。 柴胡-黃芩藥對的活性化合物如表1。

2.2 疾病靶點的篩選

通過Genecards 數據庫篩選出鼻竇炎相關靶蛋白2510 個,篩選score≥3 的基因,共有1246 個疾病靶點,將柴胡-黃芪靶點與疾病靶點信息輸入在線工具Draw Venn Diagram 進行Venn 分析,其中兩組靶標重疊部分共有92 個靶標,如圖1。

2.3 藥物—成分—靶點網絡

柴胡-黃芩藥對中與鼻竇炎相關的活性成分有39 個,交集靶點有92 個,運用Cytoscape 3.8.0 繪制“藥物-成分-靶點”網絡圖。 該圖共有133 個節點,376 條邊。 計算圖中每個節點的連接度(degree)。其程度越高,成分或靶點在網絡中發揮的作用就越關鍵。 排名前六的活性成分為quercetin(槲皮素)、kaempferol(山奈酚)、wogonin(漢黃芩素)、baicalein(黃芩素)、acacetin(刺槐素)、beta-sitosterol(β-谷甾醇)。 如圖2。

2.4 構建PPI 網絡關鍵靶點基因

通過STRING 數據庫分析92 個藥物-疾病交集靶點的相互作用,設置置信度(≥0.4)并隱藏孤立靶點,共得到92 個靶點1797 條相互作用連線的PPI 網絡(圖3A)。 使用Network Analyzer 篩選核心靶點,通過cetiscape 2.2 插件設置連接度、介度、緊密度,通過分析篩選出柴胡-黃芩治療鼻竇炎的關鍵靶點基因為TP53、AKT1、CASP3、JUN、IL6,VEGFA、MAPK1、MYC、TNF、CXCL8、EGF、PTGS2、CCND1、EGFR、MMP9 等15 個。 (圖3B)

2.5 GO 富集分析

為闡明柴胡-黃芩藥對治療鼻竇炎靶點參與的生命過程,該研究使用metascape 在線工具對92 個靶點進行GO 富集分析,GO 富集分析由細胞組成(cellular component, CC)、 分 子 功 能(molecular function, MF)、生物過程(biological process, BP)三部分組成,以P＜0.05 為篩選條件獲得BP,MF,CC富集條目分別為269,87,111 條,將排名前十的生物過程、細胞組成和分子功能利用微生信在線平臺繪制成柱狀圖及氣泡圖,見圖4、圖5。

2.6 KEGG 富集分析

利用DAVID 在線工具對92 個靶點進行KEGG富集分析分析結果顯示共富集在104 條通路上以P＜0.05 為閾值篩選排名前20 的KEGG 分析結果(Pvalue ＜0.01、基因頻率＞0.05%,),其結果涉及Pathways in cancer(癌癥的途徑)、TNF signaling pathway(TNF 信號通路)、Apoptosis(細胞凋亡)、p53 signaling pathway (p53 信 號 通 路)、 NF-kappa B signaling pathway (NF-κB 信 號 通 路)、 PI3K-Akt signaling pathway ( PI3K-Akt 信號通路) HIF-1 signaling pathway(HIF-1 信號通路)、MAPK signaling pathway(MAPK 信號通路)Toll-like receptor signaling pathway(Toll 樣受體信號通路)等通路。 根據P值選取排名Top10 的通路,利用Omicshare 在線平臺繪制氣泡圖(圖5)。

運用CytoScape3.8.0 構建成分-靶點-通路網絡圖, 見 圖 6。 通 過 CytoScape3.8.0 內 置 的NetworkAnalyzer 分析柴胡-黃芩藥對治療鼻竇炎疾病網絡拓撲學參數,根據拓撲學指標Degree 值大小,進行重要成分及重要作用靶點的篩選[18]。Cytoscape 網絡分析表明,槲皮素連接度(degree)為61,介度(betueenness centrality)為0.2692,緊密度(closeness centrality)為0.6243,預測槲皮素為柴胡-黃芩藥對治療鼻竇炎的主要成分,其次為漢黃芩素、山奈酚、黃芩素、刺槐素,見表2。 PTGS2 在網絡中的連接度為42,介度為0.1789,緊密度為0.5517,預測PTGS2 為柴胡-黃芩藥對治療鼻竇炎的主要靶點。 HSP90AA1、 PIK3CG、 PRSS1、 NOS2、 RELA、AKT1、TP53、MAPK1 亦為相對重要的靶點,見表3。a

表1 柴胡-黃芩活性化合物的基本信息Table 1 Basic information of Bupleurum-Scutellaria active compound

圖1 鼻竇炎疾病靶點與柴胡-黃芩靶點的韋恩圖Figure 1 Venn diagram of Sinusitis disease target and Bupleurum-Scutellaria target

圖2 柴胡-黃芩藥對治療鼻竇炎疾病的藥物-成分-靶點網絡Figure 2 Bupleurum-Scutellaria baicalensis’s drug for the treatment of sinusitis disease-component-target network

圖3 柴胡-黃芩治療鼻竇炎疾病的靶點PPI 網絡及其關鍵靶點網絡Figure 3 Target PPI network of Bupleurum-Scutellaria in the treatment of sinusitis and its key target network

圖4 柴胡-黃芩治療鼻竇炎疾病的靶點GO 柱狀圖Figure 4 Target GO histogram of Bupleurum-Scutellaria in the treatment of sinusitis

圖5 柴胡-黃芩治療鼻竇炎疾病潛在治療靶點的富集分析Figure 5 Enrichment analysis of potential therapeutic targets of Bupleurum-Scutellaria in the treatment of sinusitis

圖6 柴胡-黃芩藥對治療鼻竇炎疾病的成分-靶點-通路網絡圖Figure 6 The composition-target-pathway network diagram of Bupleurum-Scutellaria baicalensis for the treatment of sinusitis

2.7 分子對接結果

根據分析結果,結合PPI 中的關鍵基因和“成分-靶點-通路” 網絡的主要基因為TP53,AKT1,MAPK1,PIK3CG,PTGS2,HSP90AA1 這六個核心靶點基因,與活性成分中有效靶點個數最多的成分進行分子對接,活性成分為為quercetin(槲皮素)、kaempferol(山奈酚)、wogonin(漢黃芩素)、baicalein(黃芩素)、acacetin(刺槐素)、beta-sitosterol(β-谷甾醇),結果顯示這六種成分與TP53,AKT1,MAPK1,PTGS2,HSP90AA1,PIK3CG 對接能量均小于-5kcal/mol,beta-sitosterol 與PTGS2 和MAPK1 對接結果小于-10 kJ/mol, beta-sitosterol 與AKT1 和HSP90AA1 對接結果小于-9 kJ/mol,HSP90AA1 與黃芩素和刺槐素對接結果小于-8.5 kJ/mol。 分子對接結果見表4,關鍵靶點與活性成分的最佳復合結構見圖7。

3 討論

通過我們的研究發現,柴胡-黃芩藥對的主要核心成分為槲皮素、山奈酚、漢黃芩素、黃芩素、刺槐素、β-谷甾醇這六種。 槲皮素具有抗腫瘤,抗病毒,抗炎,降低血脂等多種藥理作用[19],槲皮素可通過對TLR 的負調節而抑制脂多糖誘導膜表面黏附分子和炎癥因子的表達,達到抗炎作用,可降低的炎癥因子為IL-1、IL-6、IL-10 等[20-21]。 山奈酚能明顯的抑制炎癥及其炎性細胞浸潤[22]。 研究表明,山奈酚可顯著抑制LPS 誘導的MDC、IP-10、IL-8 的產生[23]。 谷甾醇具有抗氧化、降低膽固醇、抗炎、免疫調節、抗腫瘤和中樞神經系統等作用[24]。 Choi等[25]人研究發現β-谷甾醇抗炎作用機制是通過減少NO 的合成,抑制巨噬細胞IL-6 活性,減少IL-1、TNF-等炎性因子的分泌。 漢黃芩素、黃芩素和刺槐素都可通過抑制相關促炎細胞因子的表達,來減輕炎癥的發生[26-29]。 由圖2 可知,槲皮素、山奈酚、漢黃芩素、黃芩素、刺槐素、β-谷甾醇均存在于柴胡-黃芩治療鼻炎疾病的有效成份當中,由此提示柴胡-黃芩藥效的發揮可能是多種化學成分量的積累作用的結果。

本次研究中,篩選出柴胡-黃芩治療鼻竇炎的關鍵靶點基因為TP53、AKT1、MAPK1、PIK3CG、PTGS2、HSP90AA1,這些靶點蛋白都與炎癥反應和免疫應答密切相關。 Tp53 通過調控許多miRNAs 的表達,誘導細胞分化、凋亡和衰老,調節細胞周期,抑制腫瘤發生等[30-31]。 AKT1 是絲氨酸/蘇氨酸激酶(AKT)中的其中一個亞型,通過磷酸化其下游底物來促進細胞生長、代謝、凋亡等重要的細胞生物學過程[32-33]。 MAPK1 又稱細胞外信號調節激酶2,是絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)的C 族亞族中的一個基因[34-35]。 MAPK1 途徑可通過磷酸化轉錄因子改變基因表達,促進炎癥因子產生巨噬細胞,并參與鼻竇炎的產生與發展過程[36-37]。 PTGS2 即為環氧合酶2(COX-2)的別稱,有研究對COX-2 表達上調,發現與p38MAPK、NF 一KB 等信號轉導通路在上皮細胞具有較強表達,表明其炎性反應機制在鼻竇炎中的作用[38-39]。且本研究還發現,多個化學成分可作用到一個靶點,如兒茶素、黃連素、漢黃芩素均可以作用到ESR1 靶點；而一個化學成分也可以作用到多個靶點,如槲皮素能夠作用到TP53、C-JUN、PPARG、ST1AT1 等多個靶點。

表2 主要活性成分網絡節點特征參數Table 2 Network node characteristic parameters of main active ingredients

表3 主要靶點網絡節點特征參數Table 3 Characteristic parameters of main target network nodes

表4 分子對接結果Table 4 Molecular docking results

通過GO 富集分析可知,柴胡-黃芩治療鼻竇炎的基因功能主要體現在對調節細胞代謝、對氧化應激的反應、生物調節和刺激反應循環系統過程等。KEGG 通路富集分析顯示了柴胡-黃芩治療鼻竇炎的主要信號通路。 在TNF 信號通路中,TNF-α 上調能促進粘附分子(ICAM-1、VCAM-1 等)和相關炎性因子(IL-1、IL-6、IL-12 等)在鼻竇炎中的表達[40-42]。NF-KB 信號通路可雙向調控炎癥和免疫相關的細胞因子表達,在與鼻竇炎有關的炎癥反應中有的重要調節作用[43-45]。 國內外大量研究表明Toll 樣受體通路(TLR 信號通路)可調節并影響Th1 /Th2 細胞因子的平衡[46],從而介入鼻竇炎的發病過程[47]。PI3K/AKT 信號通路有效抑制嗜酸性粒細胞和中性粒細胞的活化,是治療相關鼻竇炎疾病的一種新途徑[48-49]。 MAPK 信號通路參與細胞了的增殖、分化、調亡等生理病理過程。 有研究通過抑制p38MAPK 信號通路的磷酸化可減少黏膜下炎細胞浸潤,減輕鼻黏膜炎癥反應,以維持鼻竇免疫機制平衡[50-51]。

分子對接分析主要用于研究分子間(如配體和受體)的相互作用,配體與受體的結合構象越穩定,則表示結合性越強,能量越低[52-54]。 本研究以原配體作為分數對象,顯示化學成分與靶點對接分數都接近或小于原配體得分。 通過關鍵靶點與活性成分的最佳復合結構發現,β-谷甾醇和PTGS2、β-谷甾醇和MAPK1、β-谷甾醇和HSP90AA1、β-谷甾醇和AKT1、刺槐素和HSP90AA1、黃芩素和HSP90AA1均有較好的結合,因此提示柴胡-黃芩藥對的關鍵化學成分與關鍵蛋白具有較好的結合活性,也進一步佐證了基于網絡藥理學辨識有效成分的可靠性。

圖7 關鍵靶點與活性成分的最佳復合結構Figure 7 The optimal composite structure of key targets and active

本研究利用網絡藥理學和分子對接技術初步分析了柴胡-黃芩藥對治療鼻竇炎的作用機制。 但研究仍存在一些不足之處:①本研究所用數據庫的準確性與可靠性仍有待進一步考證,不同的數據庫獲得的數據與研究結果可能存在一定差異,后期還需開展多數據的研究。 ②本研究所構建生物網絡數據均為定性數據,而中藥復方內部成分復雜,相互作用關系復雜,相對于定量數據而言,本研究結論的準確性尚有待進一步提高。 ③本研究尚未涉及柴胡-黃芩藥對的劑量、煎煮方法、服用方法等對鼻炎疾病治療的實際效果,且目前臨床上也未有柴胡-黃芩藥對的動物實驗與人體實驗,后期還應該結合體內外實驗進一步驗證柴胡-黃芩藥對治療鼻竇炎疾病的分子機制。

總而言之,中藥具有多組分、多靶點、多通路、協同作用的特點,本文利用網絡藥理學對柴胡-黃芩構建網絡模型,識別潛在和活性成分,構建藥物靶點網絡和靶病網絡,分析其中藥理論研究和藥理作用。 本文的研究數據有一定的預測性和客觀性,可通過設計柴胡-黃芩藥對治療鼻竇炎的動物實驗研究進一步證實其作用機制。