松果菊苷對大鼠抑郁模型線粒體損傷的修復作用

岳凌峰馬 敬王 寧

(1.新鄉醫學院第二附屬醫院精神四科,河南 新鄉 453002； 2.新鄉醫學院第二附屬醫院心境障礙科,河南 新鄉 453002； 3.新鄉醫學院第二附屬醫院精神三科,河南 新鄉 453002)

目前,隨著中國老年人口數量日益突出,人們的健康問題已經從傳染性疾病逐漸轉變為慢性疾病,如高血壓、糖尿病和抑郁癥等[1]。 抑郁癥是一個重要的公共衛生問題,它會增加其他疾病的發病率、自殺風險增加、身體、認知和社會功能下降,最后增加死亡率[2]。 目前抗抑郁藥臨床上已應用很多,如抗驚厥藥、神經阻滯劑、單胺氧化酶抑制劑等,但這些藥物容易對人體產生副作用[3]。 因此迫切需要尋找療效確切,毒副作用小的抗抑郁藥物。松果菊苷(echinacoside, EA),又名淫羊藿苷,從肉蓯蓉中分離出的一種活性物質,化學成分是苯乙烷苷。 松果菊苷具有廣泛的生物活性,如清除自由基、抗氧化和抗炎作用[4]。 研究表明,松果菊苷可改善5-Fu 抑制的小鼠的骨髓造血功能[5]；松果菊苷可以改善心肌細胞缺氧/復氧損傷[6]；松果菊苷通過抑制淀粉樣蛋白沉積,改善淀粉樣β 肽引起的記憶障礙和膽堿能缺陷[7]；基于胃腸道代謝,松果菊苷具有改善抑郁癥癥狀的作用[8]。 但松果菊苷對抑郁癥的具體作用機制還未見報道。 本文旨在研究松果菊苷對抑郁癥模型大鼠的影響,以期為松果菊苷臨床應用治療抑郁癥提供參考。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

50 只4 ～6 周齡清潔級雄性Sprague Dawley(SD)大鼠,140～150 g,購自中國科學院實驗動物中心[SCXK(滬)2015-0004]。 實驗前一周,大鼠可以自由獲得食物和水來適應環境。 均飼養于新鄉醫學院第二附屬醫院動物中心SPF 環境[SYXK(豫)2018-0014],飼養環境保持在溫度22℃左右,相對濕度約55%～60%,12 h 晝夜交替。 本研究通過新鄉醫學院第二附屬醫院動物倫理委員會動物倫理審查(IACUC-20190205-03),實驗過程中依照3R原則給予所有動物人道主義關懷。

1.2 主要試劑與儀器

EA(貨號:S3783)購自Selleck chem,母液用DMSO 配制,使用時用生理鹽水稀釋；聚丙烯酰胺凝膠配制試劑盒(貨號:CUS531)、PVDF 膜(貨號:ISEQ00010) 和 ECL 化學發光試劑盒(貨號:WBKLS0500)購自美國Millpore 公司；氟西汀購自美國Sigma-Aldrich；膜蛋白、核蛋白和胞質蛋白抽提試劑盒(貨號:NO.C510002)購自上海生工生物工程公司；Drp1(貨號:ab56788)、p-Drp1(貨號:ab193216)兔多克隆抗體購自英國ABCAM 公司；辣根過氧化物酶標記山羊抗兔IgG(貨號:sc-2004)購自美國Santa Cruz 公司；大鼠IL-6(貨號:D6050)、IL-1β(貨號:201-LB-005)、TNF-α(貨號:210-TA-005)和IL-10(貨號:M1000B)ELISA 試劑盒購自美國R&D Systems 公司；丙二醛(Malondialdehyde,MDA)(貨號:A003-1-2)、乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase,LDH)(貨號:A020 - 2 - 2) 和超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase,SOD)(貨號:A001-3-2)試劑盒購自南京建成生物技術研究所；TUNEL 細胞凋亡檢測試劑盒(貨號:C1091)購自上海碧云天生物技術公司；MultiskanTMFC 酶標儀(貨號:1410101)購自美國Thermo Fisher 公司；BX43 顯微鏡購自日本Olympus；ChemiDoc MP 化學發光成像系統(貨號:1708280)購自美國Biorad 公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 動物分組及模型制備

50 只大鼠首先在籠子里飼養,(5 只大鼠/籠)可自由取食物和水3 d,以適應晝夜節律。 將大鼠隨機平均分為對照組和抑郁模型組。 對照組大鼠正常飼養,密度為5 只/籠。 抑郁模型組大鼠飼養密度為1 只/籠,采用Willner 報道的方法構建抑郁模型[9]。 模型組的大鼠受到14 類型的不同刺激,包括顛倒白天/黑夜(24 和48 h),重復45 度傾斜鼠籠(每隔4、12 和24 h),斷水(6 ～12 h),缺食物(12 ～24 h),噪音(金屬沖突2 h 和大鼠大聲叫嚷2 h),濕墊,外來異物,無墊(6 h),尾巴夾緊(輕微),同籠,水平振動,籠子交換和喂養環境變化。 每只大鼠每天接受一種方法的刺激,且第2 天不重復,并在籠子里單獨飼養35 d。 從第4 周開始,觀察總指標(體重、飲料量和食物量)和糖水攝入量百分比。 將20只對照組大鼠隨機分成對照組和單純EA 組:腹腔內注射EA 30 mg/(kg·d),連續35 d；將30 只模型組大鼠隨機分成模型組、治療組和氟西汀組:治療組腹腔內注射EA 30 mg/(kg·d),氟西汀組灌胃氟西汀20 mg/(kg·d)[10],連續35 d；對照組和模型組注射等量的DMSO。

1.3.2 糖水偏好實驗(Sucrose preference test,SPT)

讓大鼠習慣于飲用兩瓶1%蔗糖溶液24 h,第2天用清水更換其中1 瓶蔗糖溶液。 經過24 h 后禁食、禁水后,允許大鼠飲用1%的蔗糖溶液(100 mL)和等量的水3 h。 糖水偏好指數%=蔗糖水消耗量/(純水消耗量+蔗糖水消耗量)×100%。

1.3.3 ELISA

取各組大鼠血清,96 孔板布局,繪制標準曲線。標準濃度是以1 ∶3稀釋的最高標準。 用標準曲線測定樣品濃度。 根據說明書操作步驟,反應孔加入樣品50 μL,37℃孵育40 min,洗滌液洗滌3 次,每次2 min,然后加入生物素標記的抗體37℃避光孵育30 min,洗滌3 次后加入鏈霉親和素混勻,37℃避光孵育30 min,最后加入顯色劑避光顯色15 min,加入終止液終止反應,終止反應后于酶標儀450 nm 處檢測IL-6、IL-1β、TNF-α 和IL-10 吸光值。

1.3.4 HE 染色

將各組大鼠腦海馬區組織進行石蠟切片,厚度為4 mm,用二甲苯脫蠟,梯度乙醇脫水,蘇木素染色,水洗,鹽酸乙醇分化,水洗藍化,伊紅染色,梯度乙醇脫水,二甲苯透明,中性樹膠封片,在顯微鏡下觀察組織并拍照。

1.3.5 TUNEL 染色

將各組大鼠腦海馬區組織切片進行脫蠟、水合、透明處理,在標本上分別加入TUNEL 反應混合液,加入蓋玻片反應1 h, 隨后用PBS 溶液漂洗3次,加入DAB 底物反應10 min 后漂洗3 次后用熒光顯微鏡觀察凋亡細胞形態。 TUNEL 陽性細胞核在鏡下呈現棕色,正常細胞為藍色。 于熒光顯微鏡下隨機選取5 個視野統計TUNEL 陽性細胞及細胞總數,細胞凋亡率(%)= TUNEL 陽性細胞/總細胞數×100%。

1.3.6 流式分選檢測線粒體膜電位

將各組大鼠腦組織細胞接種于6 孔板后用PBS清洗3 次,孵育24 h,加入JC-1(5 μg/mL)室溫避光反應30 min。 用流式分選儀檢測,記錄紅色和綠色熒光強度。

1.3.7 Western blot

根據說明書,提取腦組織中細胞質蛋白；200 mg腦組織剪切成小塊,加入適量的冰冷PBS 洗滌兩次后,4℃離心3000 r/min,3 min,棄上清；收集的組織中加入1000 μL 預冷的溶液A(使用前每1 mL 溶液A 加入1 μL DTT,10 μL PMSF,1 μL 蛋白酶抑制劑和5 μL 磷酸酶抑制劑),研磨組織；渦旋震蕩10 s,冰上放置20 min,期間取出震蕩3 ～5 次,于4℃下12000 r/min 離心10 min,上清為胞質蛋白部分。 取等量胞質蛋白與適量Loading buffer 混合,100℃水浴10 min；經SDS-PAGE 分離、轉膜、封閉后,采用一抗anti-P-Drp1 進行孵育,4℃過夜,TBST 溶液洗滌3 次后采用標記HRP 的二抗進行孵育,1.5 h 后加入發光液,顯色處理,并統計灰度值,計算相應蛋白表達量,實驗重復3 次。

1.3.8 氧化應激檢測

取各組大鼠腦組織,用商業化試劑盒根據說明書檢測MDA、LDH 和SOD 的濃度。

1.4 統計學方法

本文所有對比實驗數據用SPSS 16.0 軟件進行統計學分析。 計量數據以平均數±標準差(±s)表示,兩兩比較用獨立的t檢驗,多組間比較采用單因素方差分析。P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 松果菊苷增加抑郁癥大鼠體重增長和糖水偏嗜度

與對照組(179±19)g 相比,模型組(90±18)g大鼠建模2 個月后平均增加體重遠低于對照組,大約減少89.0 g；且模型組大鼠糖水偏嗜度減少,約減少33.3%。 同時用松果菊苷處理治療組表現出增加模型大鼠增重和糖水偏嗜度(見圖1),與模型組相比,治療組(149±14)g 大鼠體重平均增加59.5 g,糖水偏嗜度平均增加24.2%,氟西汀組大鼠平均體重增加70.5 g,糖水偏嗜度平均增加28.1%。

2.2 松果菊苷降低抑郁癥大鼠炎癥細胞因子

單純EA 組與對照組細胞因子濃度差異無統計學意義；與對照組相比,模型組促炎癥因子IL-6、IL-1β 和TNF-α 水 平 增 加(F= 64.51、25.87、3.989,P＜0.01),抗炎癥因子IL-10 水平差異無統計學意義；與模型組相比較,治療組和氟西汀組促炎癥 因 子IL-6、IL-1β 和TNF-α 水 平 下 降(t=2.526、2.391、8.283 和1.792、1.943、7.839,P＜0.01),抗炎癥因子IL-10 水平增加(F= 3.000、3.667,P＜0.01)。 見圖2。

注:A:各組大鼠體重增長直方圖；B:各組大鼠糖水偏嗜度直方圖。1:對照組；2:單純EA 組；3:模型組；4:治療組；5:氟西汀組。 與對照組比較,*P＜0.01；與模型組比較,#P＜0.01。圖1 松果菊苷增加抑郁癥大鼠體重增長和糖水偏嗜度Note. A,Weight gain histogram of rats in each group. B,Histogram of sugar water preference of rats in each group.1,Control group.2,Simple EA group.3,Model group. 4, Treatment group. 5, Fluoxetine group. Compared with Control group, *P＜0.01. Compared with Model group, #P＜0.01.Figure 1 EA increased weight gain and sugar water preference in depressed rats

注:1:對照組；2:單純EA 組；3:模型組；4:治療組；5:氟西汀組。與對照組比較,*P＜0.01；與模型組比較,#P＜0.01。圖2 松果菊苷對抑郁癥大鼠炎癥細胞因子IL-6、IL-1β、TNF-α、IL-10 水平的影響Note. 1, Control group. 2, Simple EA group. 3, Model group. 4,Treatment group. 5, Fluoxetine group. Compared with Control group, *P＜0.01. Compared with Model group, #P＜0.01.Figure 2 EA Effects of EA on levels of inflammatory cytokines IL-6, IL-1β, TNF-α and IL-10 in depressed rats

2.3 松果菊苷改善抑郁癥大鼠腦損傷,減少腦組織細胞凋亡

單純EA 組與對照組腦損傷差異無統計學意義,說明EA 對正常大鼠無細胞毒性。 模型組相較于對照組大鼠腦海馬區組織出現大量空泡、染色質濃縮、邊緣化,細胞凋亡率升高(F= 92.84,P＜0.01)；與模型組相比較治療組和氟西汀組大鼠腦海馬區組織損傷程度減輕,空泡減少,細胞凋亡率降低(t=2.034、1.933,P＜0.01)。 見圖3。

2.4 松果菊苷降低抑郁癥大鼠腦線粒體膜電位

通過流式分選檢測細胞線粒體膜電位的變化,與對照組相比,模型組線粒體膜電位升高(F=202.03,P＜0.01)；與模型組相比,治療組和氟西汀組線粒體膜電位降低(t=3.486、2.074,P＜0.01)。見圖4。

2.5 松果菊苷改善抑郁癥大鼠腦線粒體損傷

通過Western blot 檢測線粒體損傷標志物表達情況,與對照組相比,模型組胞質內磷酸化線粒體動力相關蛋白(p-Drp1 蛋白)表達水平降低(F=94.82,P＜0.01)；與模型組相比,治療組和氟西汀組p-Drp1 蛋白提高(t=1.200、1.188,P＜0.01)。 見圖5。

2.6 松果菊苷改善抑郁癥大鼠腦氧化應激損傷

與對照組相比,模型組胞質內乳酸脫氫酶(LDH) 和丙二醛(MDA) 水平增加(F= 15.93、66.01,P＜0.01),超氧化物歧化酶(SOD)水平降低(F=4.503,P＜0.01)；與模型組相比,治療組和氟西汀組LDH 和MDA 水平下降(t= 5.154、3.815 和4.778、3.952,P＜0.01),SOD 水平提高(t=6.133、6.500,P＜0.01)。 見圖6。

3 討論

抑郁癥是一種慢性情緒障礙疾病。 抑郁癥的形成原因多種多樣,比如壓力和創傷、吸煙、飲食不規律、缺乏鍛煉、睡眠狀況、牙周疾病以及糖尿病等[11]。 CUMS 是其中一種抑郁癥動物模型,即低水平的慢性和不可預測的應激源,類似于人類在日常生活中可能經歷的刺激,會在脆弱的個體中誘發抑郁[9]。 CUMS 會導致一系列行為缺陷,包括蔗糖偏好降低、獎勵刺激動機減少、性行為以及攻擊性增加、焦慮樣行為和睡眠模式改變。 研究表明,CUMS在雄性和雌性大鼠中均誘導了類似抑郁的表型[12]。本研究采用了14 種不同類型的輕度刺激,誘導了成年雄性大鼠抑郁模型。 結果表明,模型大鼠體重減少,蔗糖偏好降低。

注:A:HE 染色檢測各組大鼠腦組織損傷；B:TUNEL 染色檢測各組大鼠腦組織細胞凋亡；C:各組大鼠腦組細胞凋亡率直方圖。 1:對照組；2:單純EA 組；3:模型組；4:治療組；5:氟西汀組。 與對照組比較,*P＜0.01；與模型組比較,#P＜0.01。圖3 松果菊苷改善抑郁癥大鼠腦損傷Note. A,He staining was used to detect brain tissue damage in each group. B,TUNEL staining was used to detect the apoptosis of brain tissue cells in each group. C, Histogram of apoptosis rate in brain groups of rats. 1, Control group. 2, Simple EA group. 3, Model group. 4, Treatment group. 5,Fluoxetine group. Compared with Control group, *P＜0.01. Compared with Model group, #P＜0.01.Figure 3 EA improves brain damage in depressed rats

注:A:流式分選檢測各組大鼠線粒體膜電位的變化；B:各組大鼠JC-1 紅/綠比值。 1:對照組；2:單純EA 組；3:模型組；4:治療組；5:氟西汀組。 與對照組比較,*P＜0.01；與模型組比較,#P＜0.01。圖4 松果菊苷降低抑郁癥大鼠腦線粒體膜電位Note. A, The changes of mitochondrial membrane potential in each group were detected by flow sorting. B, Red/green ratio of JC-1 in each group.1, Control group. 2, Simple EA group. 3, Model group. 4, Treatment group. 5, Fluoxetine group. Compared with Control group, *P ＜0.01.Compared with Model group, #P＜0.01.Figure 4 EA decreased mitochondrial membrane potential in depressed rats

注:A:Western blot 檢測線粒體損傷標志物表達；B:p-Drp1 蛋白表達直方圖。 1:對照組；2:單純EA 組；3:模型組；4:治療組；5:氟西汀組。與對照組比較,*P＜0.01；與模型組比較,#P＜0.01。圖5 松果菊苷改善抑郁癥大鼠腦線粒體損傷Note. A, The expression of mitochondrial injury markers was detected by Western blot. B, Histogram of p-Drp1 protein expression. 1, Control group. 2, Simple EA group. 3, Model group. 4, Treatment group. 5, Fluoxetine group. Compared with Control group, *P＜0.01. Compared with Model group, #P＜0.01.Figure 5 EA reduced mitochondrial injury in depressed rats

注:A:各組大鼠LDH 水平直方圖；B:各組大鼠SOD 水平直方圖；C:各組大鼠MDA 水平直方圖。 1:對照組；2:單純EA 組；3:模型組；4:治療組；5:氟西汀組。 與對照組比較,*P＜0.01；與模型組比較,#P＜0.01。圖6 松果菊苷改善抑郁癥大鼠腦氧化應激損傷Note. A, Histogram of LDH level in each group. B, histogram of SOD level of rats in each group. C, Histogram of MDA level in each group. 1,Control group. 2, Simple EA group. 3, Model group. 4, Treatment group. 5, Fluoxetine group. Compared with Control group, *P ＜0.01.Compared with Model group, #P＜0.01.Figure 6 EA reduced oxidative stress injury in depressed rats

松果菊苷已經被證明具有增強腎功能、治療血栓、陽痿、早泄和男性不育癥,且有助于減輕老年人便秘[13]。 炎癥是抑郁癥的重要病因之一,抑郁癥患者具有炎癥反應的所有主要特征,包括促炎癥細胞因子及其受體的表達增加以及急性期反應物、趨化因子和可溶性粘附分子在外周血和腦脊液中的水平增加[14]。

馮磊等[15]研究發現抑郁癥患者血漿BDNF 降低,IL-6、IL-1 抑上升,參與抑郁癥的發生發展過程。IL-10 是Th2 細胞分泌的一種多功能性細胞因子,起免疫抑制作用[16]。 本文研究表明,松果菊苷具有治療抑郁癥的潛力。 研究表明松果菊苷可以減輕炎癥,從而減輕脂多糖誘導的急性肝損傷和腸炎[17-18]。 與上述文獻一致,本研究也證實了松果菊苷抗炎的特性。 實驗證明松果菊苷可以降低炎癥因子如IL-6、IL-1 文水平,增加抗炎細胞因子IL-10水平,說明松果菊苷可能通過減少炎癥反應緩解大鼠抑郁癥。

線粒體異常是抑郁癥的常見發病機制,線粒體在能量代謝中起著重要作用[19]。 眾所周知,線粒體氧化磷酸化系統產生自由基,電子傳遞鏈本身易受到自由基的損傷[20]。 由于線粒體DNA 不受組蛋白的保護,線粒體在ATP 合成過程中產生活性氧,因而容易發生氧化損傷[21]。 線粒體損傷是由生化級聯的改變引起的,電子傳遞鏈的損傷被認為是一系列精神障礙的重要因素, 如重度抑郁障礙(MDD)[22-23]。 LDH、MDA 和SOD 是氧化應激的標志物,含量高低可反映細胞氧化應激損傷程度[24]。發動蛋白相關蛋白1(dynamin-related protein 1,Drp1)在細胞新陳代謝、凋亡和線粒體自噬中發揮重要作用,當神經元線粒體功能異常,導致神經元損傷和突觸聯系建立異常[25]。 研究表明,松果菊苷可以減少ROS 的產生來保護PC12 細胞中由6-羥多巴胺引起的線粒體功能障礙和炎癥反應[26]。 本文研究表明,松果菊苷可以降低抑郁癥大鼠線粒體膜電位、氧化應激水平和線粒體損傷,體現在松果菊苷抑制MDA 和LDH,增加SOD 和p-Drp1 蛋白。

綜上所述,松果菊苷可以減少炎癥反應、降低抑郁癥大鼠氧化應激水平和線粒體損傷,從而緩解大鼠抑郁癥。 本研究表明松果菊苷可能成為抗抑郁的潛在藥物。