mmu-miR-672-5p 調控大鼠胎盤絨毛膜滋養層細胞凋亡的機制

陳 琳周 知馬 寧周 璟

(海南省婦女兒童醫學中心生殖醫學中心,海口 570206)

胎盤的形成對于哺乳動物懷孕至關重要,其形成需要對滋養細胞的精確調控[1]。 子宮內膜中的滋養層細胞經歷母體蛻膜和子宮螺旋動脈的增殖,分化,凋亡和侵襲,從而參與血管重塑[2]。 滋養細胞功能異常與不良妊娠并發癥密切相關,包括先兆子癇,其特征是出現高血壓,蛋白尿和水腫,這將會嚴重損害孕產婦的健康和胎兒的成長[3]。 因此,滋養細胞功能的精確調節對于維持正常胎盤至關重要。 有證據表明胎盤miRNA 的異常表達與先兆子癇相關[4]。 miRNA 是小的非編碼RNA,主要在轉錄后水平上對靶基因的表達產生負調控[5]。 miRNA在許多病理和生理過程(例如細胞生長和凋亡,器官發生和發育)中起重要作用[6]。 Pineles 等[7]發現子癇前期患者胎盤中miR-672-5p 表達異常。 但是miR-672-5p 的生理學功能仍然未知,其是否與細胞凋亡相關值得探索。 基于此,本研究使用大鼠胎盤絨毛膜滋養層細胞作為研究對象,旨在探討mmumiR-672-5p 調控大鼠胎盤絨毛膜滋養層細胞凋亡的分子機制。

1 材料和方法

1.1 實驗細胞

大鼠胎盤絨毛膜滋養層細胞購自procell(貨號:CP-R182；批號:OI2HO3)。

1.2 主要試劑與儀器

Lipofectamine 3000 購自北京科博晟創生物科技有限公司(貨號:L3000008；批號:367H-TCSE9P0)；大鼠胎盤絨毛膜滋養層細胞完全培養基購自procell(貨號:CM-R182；批號:ZDJH23)；pmir-glo utr1 質粒購自廣州基旦生物科技有限公司(貨號:JD190929001M； 批 號: C6XHL7QALI)； mmu-miR-672-5p inhibitor、mmu-miR-672-5p mimics 均購自北京 擎 科 合 成；Zfp229、Zfp503、Slc4a5、Stk24、Tmem106b、Bax、Adgrb3、Tmem63b、Pmp22、Mroh2a、Dsn1、Pramef25、Naaladl2、Clk2、Stx16、Usp28、Clint1、Jph4、Msl2、Krtap8-1、Pkp2、Mllt3、Rai14 的siRNA 均由吉凱基因合成；Bax 過表達質粒通過大鼠胎盤絨毛膜滋養層細胞的cDNA 克隆至pCDNA3.1 表達載體上。 逆轉錄試劑盒購自昆明皇寶商貿有限公司(貨號:218161；批號:3YR6CWE7)；2×SDS 蛋白電泳上樣緩沖液購自武漢潔洋盛科技有限公司(貨號:M337-5ML；批號:NH4KPG2DH6)；雙熒光素酶報告基因試劑盒購自武漢純度生物科技有限公司(貨號:CDLG-4997；批號:UJV93S3Z27)；熒光定量PCR 試劑盒購自上海兢蔚生物科技有限公司(貨號:BL705A；批號:1VG4GA2N)；TRIzol 試劑購自四川愛奇生物科技有限公司(貨號:15596-026；批號:MA6-WP6CZCW8)；Bax、GAPDH、CLEAVED-CAS3的抗體購自abcam(貨號:ab32503、ab9482、ab2302；批號:PNCER6SXJ5T58BC8、YN1J21A4YKBMXTO7、ODQ7K45DO3FMO7IC)；二抗購自北京?？气檮撋锟萍加邢薰?貨號:Y2011)；ECL 化學發光系統ChemiDocTMXRS + 購 自 Bio-rad 公 司( 型 號:1708265)；CFX96 Touch 熒光定量PCR 檢測系統購自Bio-rad 公司(型號:1845096)。

1.3 實驗方法

1.3.1 細胞培養與轉染

使用大鼠胎盤絨毛膜滋養層細胞完全培養基在37°C,5% CO2的培養箱中培養大鼠胎盤絨毛膜滋養層細胞。 每2 d 更換一次培養基。 將轉染試劑與 mmu-miR-672-5p inhibitor、 mmu-miR-672-5p mimics、Bax 質粒、siRNA(Zfp229、Zfp503、Slc4a5、Stk24、Tmem106b、Bax、Adgrb3、Tmem63b、Pmp22、Mroh2a、Dsn1、Pramef25、Naaladl2、Clk2、Stx16、Usp28、Clint1、Jph4、Msl2、Krtap8 - 1、Pkp2、Mllt3、Rai14)混合后在室溫下孵育15 min 后,緩緩滴入大鼠胎盤絨毛膜滋養層細胞中。

1.3.2 免疫印跡

通過蛋白質印跡檢測BAX 和CLEAVED-CAS3的豐度。 使用放射免疫沉淀測定(RIPA)緩沖液裂解細胞。 用SDS-PAGE 分離總蛋白(30 μg),然后轉移到聚偏二氟乙烯膜上。 將膜與抗BAX(1 ∶1000稀釋),抗CLEAVED-CAS3(1 ∶1000 稀 釋) 或 抗GAPDH(1 ∶1000 稀釋)在4°C 孵育過夜。 然后將膜用TBST 洗滌3 次,并與辣根過氧化物酶偶聯的二抗(1 ∶5000 稀釋)孵育1 h。 使用增強的化學發光(ECL)試劑可視化蛋白質豐度。

1.3.3 熒光素酶報告實驗

將Bax 的3 端非編碼區克隆至pmir-glo utr1 載體上,作為pmir-glo utr1-Bax-WT。 將Bax 的3’端非編碼區做G→C 突變后,克隆至pmir-glo utr1 載體上,作為pmir-glo utr1-Bax-MT。 將大鼠胎盤絨毛膜滋養層細胞與pmir-glo utr1-Bax-MT(800 ng)、pmirglo utr1-Bax-WT(800 ng)、對照載體(800 ng)、TK Renilla 報告基因(8 ng)根據試劑盒說明,使用Lipofectamine 3000 進行轉染。 轉染48 h 后,裂解了總細胞蛋白,并使用雙重熒光素酶測定系統檢測了熒光素酶活性(螢火蟲和海腎)。

1.3.4 Annexin-V 染色

經過不同處理后,收集在6 孔板上生長的漂浮大鼠胎盤絨毛膜滋養層細胞和胰蛋白酶分離的細胞,并用4℃預冷的1×PBS 洗滌。 然后將細胞沉淀物用結合緩沖液重懸,并根據試劑盒方案用Annexin-V 染色。 熒光顯微鏡觀察。 將實驗組中凋亡細胞的百分比與對照轉染組進行比較。 所有樣品一式三份測量。

1.3.5 RNA-Seq

分別敲低和過表達mmu-miR-672-5p 后,抽取大鼠胎盤絨毛膜滋養層細胞的總RNA。 RNA 樣品被送到北京基因組研究所(中國深圳)進行商業性RNA-Seq 服務和數據分析。 使用SOAPaligner/SOAP2 不匹配,將干凈的讀段映射到mouse 數據庫。 計算每個基因的純凈讀數數,然后將其標準化為每百萬分之一讀數(kbKM),該讀數將讀數數與基因表達水平相關。 利用log2 比率來確定基因調控。 選擇log2 比率為-1 或log2 比率為1 的免疫基因進行進一步分析。

1.3.6 RNA 抽取與實時熒光定量PCR

使用逆轉錄定量PCR 對mmu-miR-672-5p 和Bax 的mRNA 豐度進行定量。 根據生產商的說明,使用總RNA 分離試劑從大鼠胎盤絨毛膜滋養層細胞中分離總RNA。 使用Prime Script RT Master Mix在20 μL 反應中將1 μg 總RNA 反轉錄為cDNA。根據制造商的說明,使用cDNA 作為模板和StepOne Plus 進行定量PCR。 使用針對mmu-miR-672-5p 和Bax 設計的引物擴增10 μL 反應體積中的1 μL cDNA。 所有mRNA 反應的PCR 條件是:在95°C 初始變性30 s、在95°C 進行5 s、在62°C 進行30 s 和40 個循環。 擴增方案后進行熔解曲線分析。 將每個mRNA 的豐度相對于每個樣品中的GAPDH 標準化。

1.4 統計學方法

所有統計分析均使用SPSS 軟件20.0,數據以平均數±標準差(±s)表示。 采用單因素組間比較采用單因素方差分析,方差齊者采用LSD 法比較,方差不齊者采用Tamhane′T2 法比較,以P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 mmu-miR-672-5p 抑制大鼠胎盤絨毛膜滋養層細胞凋亡

如圖1 所示,轉染mmu-miR-672-5p mimics 過表達mmu-miR-672-5p 后,發現大鼠胎盤絨毛膜滋養層細胞的凋亡水平下降(P＜0.05)；轉染mmu-miR-672-5p inhibitor 敲低mmu-miR-672-5p 后,發現大鼠胎盤絨毛膜滋養層細胞的凋亡水平上升(P＜0.05)。

2.2 mmu-miR-672-5p 在大鼠胎盤絨毛膜滋養層細胞調控多種基因表達

如圖2 所示,分別敲低和過表達mmu-miR-672-5p 后,通過高通量測序發現大鼠胎盤絨毛膜滋養層細胞中多種基因的表達被調節,以mmu-miR-672-5p inhibitor/mmu-miR-672-5p mimics Ratio 等于2 為閾值,大于閾值的基因有23 個,分別為Zfp229、Zfp503、Slc4a5、Stk24、Tmem106b、Bax、Adgrb3、Tmem63b、Pmp22、Mroh2a、Dsn1、Pramef25、Naaladl2、Clk2、Stx16、Usp28、Clint1、Jph4、Msl2、Krtap8-1、Pkp2、Mllt3、Rai14。

2.3 Bax 促進大鼠胎盤絨毛膜滋養層細胞凋亡

通過siRNA 敲低上述23 個基因,發現當敲低Zfp229、Zfp503、Slc4a5、Stk24、Tmem106b、Bax、Adgrb3、Tmem63b、Pmp22、Mroh2a、Dsn1、Pramef25、Naaladl2、Clk2、Stx16、Usp28、Clint1、Jph4、Msl2、Krtap8-1、Pkp2、Mllt3、Rai14 時,大鼠胎盤絨毛膜滋養層細胞的凋亡水平差異無顯著性(P＞0.05)；當敲低Bax 時,大鼠胎盤絨毛膜滋養層細胞的凋亡水平下降(P＜0.05),見圖3。 通過轉染Bax 質粒過表達Bax,發現CLEAVED-CAS3 的表達水平上升(圖4),大鼠胎盤絨毛膜滋養層細胞的凋亡水平上升(P＜0.05)(圖4)。

2.4 mmu-miR-672-5p 靶向Bax 的3 端非編碼區

轉染mmu-miR-672-5p mimics 過表達mmu-miR-672-5p 后,發現Bax 的mRNA 和蛋白水平均下降(P＜0.05)；轉染mmu-miR-672-5p inhibitor 敲低mmumiR-672-5p 后,發現Bax 的mRNA 和蛋白水平均上升(P＜0.05),見圖5。 通過熒光素酶報告系統,發現mmu-miR-672-5p 靶向Bax 的3 端非編碼區(P＜0.05),見圖5。

2.5 mmu-miR-672-5p/Bax 回補實驗

同時過表達mmu-miR-672-5p 和Bax 后,發現大鼠胎盤絨毛膜滋養層細胞的凋亡水平無顯著變化(P＞0.05),見圖6；同時敲低mmu-miR-672-5p 和Bax 后,發現大鼠胎盤絨毛膜滋養層細胞的凋亡水平無顯著變化(P＞0.05),見圖6。

注:綠色染料:Annexin-V 陽性細胞的凋亡細胞；藍色染料:dsDNA 陽性的細胞；mmu-miR-672-5p mimics 組與Control 組比較,#P＜0.05；mmu-miR-672-5p inhibitor 組與Control 組比較,*P＜0.05。圖1 mmu-miR-672-5p 促進大鼠胎盤絨毛膜滋養層細胞凋亡Note. Green dye, Annexin-V positive apoptotic cells. Blue dye, dsDNA cells. Comparison between the mmu-miR-672-5p Mimics group and the control group, #P＜0.05. Comparison of mmu-miR-672-5p inhibitor group and control group, *P＜0.05.Figure 1 mmu-miR-672-5p promotes apoptosis of placental trophoblast cells in rats

3 討論

本研究通過過表達或敲低mmu-miR-672-5p 體外培養的大鼠胎盤絨毛膜滋養層細胞,發現mmumiR-672-5p 抑制大鼠胎盤絨毛膜滋養層細胞凋亡。并通過RNA-seq 和RNAi 的方法發現mmu-miR-672-5p 靶向Bax 的3’端非編碼區后,抑制了大鼠胎盤絨毛膜滋養層細胞凋亡。 本研究發現了大鼠胎盤絨毛膜滋養層細胞凋亡的新機制,為治療子癇前期患者提供了理論基礎。

子癇前期是一種主要針對孕婦的主要高血壓疾病,是全球孕產婦發病的主要原因[8]。 它的特征是新發高血壓,以及妊娠20 周后的蛋白尿[9]。 該病的原因可能與母親、胎盤和/或胎兒相關,并且可能包括許多因素,例如免疫調節異常,內皮細胞損傷,遺傳因素和營養因素[10]。 然而,沒有任何一個因素可以令人滿意地解釋其原因和機制子癇前期。 一些研究報道[11],滋養層細胞凋亡發生在子癇前期中,并可能在疾病過程中起關鍵作用。 提示人體內mmu-miR-672-5p 的同源miR-672-5p 可能在子癇前期中表達失調,并且在子癇前期的發生發展中起重要作用,但這需要進一步的驗證。 然而,miRNA 在子癇前期患者的滋養層細胞凋亡是否發揮主要的作用仍然值得進一步探究。

miRNA 是小的非編碼RNA 分子(19 ～22 nt),參與靶標mRNA 的轉錄后調控[12]。 先前的研究表明[13],miRNA 與許多生物學和病理學過程密切相關,包括細胞增殖,凋亡,腫瘤發生,以及多種疾病。越來越多的證據表明[14],有許多miRNA 參與了子癇前期。 目前[15],已知至少有500 種不同的miRNA在胎盤滋養細胞中表達。 越來越多的證據表明[16],miRNA 在子癇前胎盤中表達異常,并與子癇前期密切相關。 在這項研究中,過表達mmu-miR-672-5p后,大鼠胎盤絨毛膜滋養層細胞的凋亡水平下降(P＜0.05)；敲低mmu-miR-672-5p 后,大鼠胎盤絨毛膜滋養層細胞的凋亡水平上升(P＜0.05)。 Pineles等[7]發現子癇前期患者胎盤中miR-672-5p 表達異常。 因此,mmu-miR-672-5p 同源miRNA miR-672-5p 的異常表達可能是使子癇前期滋養層細胞凋亡的關鍵分子。 分別敲低和過表達mmu-miR-672-5p后,高通量測序發現大鼠胎盤絨毛膜滋養層細胞中多種基因的表達被調節,包括Zfp229、Zfp503、Slc4a5、Stk24、Tmem106b、Bax、Adgrb3、Tmem63b、Pmp22、Mroh2a、Dsn1、Pramef25、Naaladl2、Clk2、Stx16、Usp28、Clint1、Jph4、Msl2、Krtap8 - 1、Pkp2、Mllt3、Rai14。 敲低上述基因后,發現僅在敲低Bax時,大鼠胎盤絨毛膜滋養層細胞的凋亡水平下降(P＜0.05)。 但是,除了Bax 基因,其他潛在受mmumiR-672-5p 調控的基因是否在子癇前期發生進展中發揮其他的作用仍值得進一步探究,包括細胞生長、器官發生和發育。 同時,本研究只選取了mmumiR-672-5p inhibitor/mmu-miR-672-5p mimics Ratio大于2 的基因來進行凋亡相關作用的研究,至于其他被Ratio 的基因是否在細胞凋亡中發揮作用值得進一步探討。 此外,mmu-miR-672-5p 靶向Bax 的3端非編碼區(P＜0.05)。 過表達mmu-miR-672-5p后,Bax 的mRNA 和蛋白水平均下降(P＜0.05)；敲低mmu-miR-672-5p 后,Bax 的mRNA 和蛋白水平均上升(P＜0.05)。 因此,mmu-miR-672-5p 通過與Bax的mRNA 形成雙鏈RNA 后,Bax 的mRNA 被降解,隨后Bax 蛋白的表達水平下降。

圖2 mmu-miR-672-5p 在大鼠胎盤絨毛膜滋養層細胞調控多種基于表達Figure 2 Expression based regulation of mmu-miR-672-5p in rat placental chorionic trophoblasts

注:siBax 組與siGFP 比較,*P＜0.05。圖3 敲低相關基因后,大鼠胎盤絨毛膜滋養層細胞的凋亡水平Note. Comparison between siBax group and siGFP group, *P＜0.05.Figure 3 apoptosis level of trophoblast cells in placenta of rats after knockdown of related genes

注:Bax 組與Vector 組比較,*P＜0.05。圖4 Bax 促進大鼠胎盤絨毛膜滋養層細胞凋亡Note. Comparison between Bax group and Vector group, *P＜0.05.Figure 4 Bax promotes apoptosis of trophoblast cells in placenta of rats

注:mmu-miR-672-5p mimics 組與control 組比較,#P＜0.05；mmu-miR-672-5p inhibitor 組與control 組比較,*P＜0.05；Bax-3’UTR-WT 組與control 組比較,*P＜0.05。圖5 mmu-miR-672-5p 靶向Bax 的3 端非編碼區Note. Comparison between the mmu-miR-672-5p Mimics group and the control group, #P ＜0.05. Comparison between mmu-miR-672-5p inhibitor group and control group, *P＜0.05. Comparison between Bax-3 ′UTR-WT group and control group, *P＜0.05.Figure 5 3-terminal noncoding region of mmu-miR-672-5p targeting Bax

注:mmu-miR-672-5p mimics 組與control 組比較,*P＜0.05；mmu-miR-672-5p inhibitor 組與control 組比較,*P＜0.05。圖6 同時過表達Bax 和mmu-miR-672-5p 后大鼠胎盤絨毛膜滋養層細胞的凋亡水平Note. Comparison between the mmu-miR-672-5p mimics group and the control group, *P＜0.05. Comparison between mmu-miR-672-5p inhibitor group and control group, *P＜0.05.Figure 6 Apoptosis level of placental trophoblast cells in rats after simultaneous overexpression of Bax and mmu-miR-672-5p

Bax 編碼的蛋白質屬于BCL2 蛋白質家族[17]。BCL2 家族成員形成異二聚體或同二聚體,并作為抗凋亡或促凋亡調節劑,參與多種細胞活動[18]。Bax 與BCL2 形成異二聚體,并起凋亡激活劑的作用[19]。 過表達Bax 后,CLEAVED-CAS3 的表達水平上升,大鼠胎盤絨毛膜滋養層細胞的凋亡水平上升(P＜0.05)。 BAX 與BCL2 的關聯和比例也決定了細胞凋亡后細胞的存活或死亡[20]。 據報道[21],Bax與線粒體電壓依賴性陰離子通道(VDAC)相互作用并增加其開放性,從而導致膜電位的喪失和細胞色素c 的釋放。 同時,caspase3 被切割形成CLEAVEDCAS3,隨后引起細胞的凋亡。 同時過表達mmumiR-672-5p 和Bax 后,大鼠胎盤絨毛膜滋養層細胞的凋亡水平無顯著變化(P＞0.05)；同時敲低mmumiR-672-5p 和Bax 后,發現大鼠胎盤絨毛膜滋養層細胞的凋亡水平無顯著變化(P＞0.05)。 因此,mmu-miR-672-5p 是Bax 引起凋亡的上游,并且Bax是miR-672-5p 下游中引起大鼠胎盤絨毛膜滋養層細胞凋亡的關鍵分子。

綜上所述,mmu-miR-672-5p 通過靶向Bax 的3端非編碼區,降低了Bax 的表達水平,隨后抑制了大鼠胎盤絨毛膜滋養層細胞的凋亡。