豬圓環病毒3型實時熒光定量PCR檢測方法的建立

駱輝，陰文奇，高露茜，王雪濤，羅旭，廖果，李書偉，周遠成*

（1.四川省畜牧科學研究院，畜禽生物制品四川省重點實驗室，動物遺傳育種四川省重點實驗室，四川成都 610066；2.畜科生物工程有限公司，四川省動物生物制品工程技術研究中心，四川成都 610200）

豬圓環病毒3 型（PCV3）是一種新型圓環病毒，2016 年首次在患有豬皮炎腎病綜合征（PDNS）與繁殖障礙的母豬及其流產胎兒體內被鑒定發現［1］。基因分析發現PCV3與PCV2、PCV1基因組之間的同源性較低，并且抗原蛋白Cap 之間不具有交叉保護性［2］。相關研究表明，PCV3已經在我國出現并且流行了很長一段時間［3］。PCV3 常以混合感染的形式出現，給養豬業的疾病防控帶來了一定困難，因此，快速準確地診斷豬群的感染狀態對于預防和控制豬圓環病毒具有十分重要的意義。目前，實時熒光定量PCR檢測技術以其簡便快捷、靈敏度高、特異性強等特點在臨床上得到廣泛應用。本研究通過設計針對PCV3 ORF2 的特異性引物，探索引物和探針最佳工作濃度，進一步確定最適反應體系及擴增條件，期望應用熒光定量PCR技術建立定量檢測PCV3的方法。

1 試驗材料

1.1 主要試劑及儀器設備 試劑：2×Premix Ex TaqTM、DL2000 DNA Marker，均購自寶日醫生物技術（北京）有限公司；病毒基因組DNA提取試劑盒，購自康寧生命科學（吳江）有限公司。儀器：NanoDrop 2000（微量分光光度計，ThermoFisher Scientific）；實時熒光定量PCR 儀（CFX Connect Real-Time system，BIO RAD）。

1.2 相關引物及探針 參照GenBank 中發表的PCV3 基因組序列，針對豬圓環病毒ORF2 保守區域，應用生物信息軟件Primer Premier 5.0 分別設計一對特異性引物和一條標記FAM 熒光報告基團的TaqMan MGB 探針，并送生工生物工程（上海）有限公司合成。引物和探針序列信息詳見表1。

表1 PCV3引物及探針序列信息

2 試驗方法

2.1 重組質粒標準品的制備 參照DNA 試劑盒提取說明書提取PCV3 陽性病料DNA，并以其為模板用上述PCV3 引物進行目的基因擴增，擴增產物經1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測陽性目的基因，回收純化PCR 擴增產物并克隆至pDC316 載體，連接產物轉化E.ColiDH5α感受態細胞，挑取在氨芐青霉素抗性LB 平板上生長的陽性克隆，測序正確后提取質粒。使用NanoDrop 2000 測定質粒濃度，按以下公式計算拷貝數：拷貝數（拷貝/μL）＝（6.02×1023）×（質粒濃度×10-9）/（DNA 長度×660）。

2.2 引物和標記探針最佳工作濃度的確定 將濃度為10 μmol/L的引物和探針，分別用ddH2O稀釋至終濃度為0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 μmol/L，以上述重組質粒標準品為模板，利用矩陣法進行熒光定量PCR 試驗，篩選最適工作濃度，以獲得的最小Ct值及典型的S型擴增曲線為判定依據。

2.3 酶最適添加量的確定 在引物和探針最佳工作濃度條件下，于擴增體系中依次添加4、6、8、10、12 μL 酶量，進行熒光定量PCR 試驗，篩選酶最適添加量。

2.4 最佳退火延伸溫度的確定 在引物和探針最佳工作濃度以及最適酶添加量條件下，退火延伸溫度分別設置為55 ℃、56 ℃、57 ℃、58 ℃、59 ℃、60 ℃、61 ℃和62 ℃，進行熒光定量PCR試驗，篩選最佳退火延伸溫度。

2.5 標準曲線的建立 將PCV3 標準質粒進行10 倍系列稀釋，選取7 個稀釋度的標準品模板，以確定的最適反應體系及擴增條件進行熒光定量PCR擴增。以每反應拷貝數的對數為X軸，循環閾值（Ct 值）為Y軸作回歸曲線，建立質粒拷貝濃度與循環閾值對應的定量標準曲線。

2.6 特異性、敏感性及重復性試驗

2.6.1 特異性試驗 提取豬繁殖與呼吸綜合征病毒、豬圓環病毒2 型、豬細小病毒、豬乙型腦炎病毒、豬傳染性胃腸炎病毒、豬流行性腹瀉病毒和豬偽狂犬病毒核酸，同時以PCV3 重組質粒標準品為陽性對照，按優化的反應體系和擴增條件進行熒光定量PCR 試驗，另設立空白對照，驗證該檢測方法的特異性。

2.6.2 敏感性試驗 將PCV3質粒標準品作10倍系列稀釋，按照建立的PCV3 熒光定量PCR 檢測方法進行試驗，同時進行常規PCR 方法檢測，比較兩者的敏感性。

2.6.3 重復性試驗 選取3個稀釋度重組質粒為模板，進行熒光定量PCR檢測，共檢測3次且每個稀釋度做3個平行試驗，對Ct 值結果進行統計學分析，并計算組間及組內變異系數（CV），以驗證所建立的熒光定量PCR方法的重復性。

2.7 對臨床樣品PCV3 的檢測 應用本研究建立的熒光定量PCR 方法對2018～2020 年從四川省不同地區收集的329 份正常豬血清、56 份流產胎兒、29份精液、102份唾液拭子進行PCV3檢測，通過PCV3 陽性率了解目前四川省內PCV3 的流行狀況。

3 結果

3.1 最佳反應體系及擴增條件的確定 制備的PCV3 重組質粒標準品測定濃度為311.1 ng/μL，換算成拷貝數是7.87×1010拷貝/μL。以PCV3重組質粒標準品為模板進行熒光定量PCR 試驗，篩選出的最佳反應體系及擴增條件結果見表2。檢測PCV3 所用引物及探針的最適終濃度均為0.5 μmol/L，反應體系中酶最適添加量為12 μL，最優擴增條件為：95 ℃3 min；95 ℃10 s，60 ℃30 s，循環40次。

表2 熒光定量PCR檢測方法的最佳反應體系

3.2 PCV3 標準曲線 不同稀釋度PCV3 標準品（濃度為7.87×103～7.87×109拷貝/μL）的熒光定量PCR 擴增結果見圖1，由此獲得的標準曲線回歸方程為：y＝-3.467 5x＋40.365，相關系數（R2）為0.999 6，擴增效率E為0.94（見圖2）。表明所設計的引物及探針的擴增效率和結合率高，優化的反應條件適宜，可用于PCV3 核酸的定性和定量檢測。

3.3 特異性、敏感性及重復性試驗結果 特異性試驗結果顯示，除PCV3重組質粒標準品外，其余樣品均未出現特異性擴增，表明本研究建立的熒光定量PCR 檢測方法的特異性良好。敏感性試驗結果見表3，熒光定量PCR 方法的最低檢測值為7.87×101拷貝/μL，而常規PCR方法最低檢測值為7.87×103拷貝/μL，表明本研究建立的PCV3 熒光定量PCR方法的敏感性優于常規PCR方法，檢出率更高。重復性試驗結果顯示，不同濃度標準品模板的組內重復性試驗變異系數為0.30%～0.81%，組間變異系數為0.39%～0.93%，可見PCV3 質粒標準品重復檢測的變異系數均小于1%（表4），表明該方法的穩定性和重復性好。

圖1 不同稀釋度PCV3質粒標準品的熒光定量PCR擴增結果

圖2 熒光定量PCR檢測PCV3的標準曲線

表3 熒光定量PCR方法的敏感性試驗結果

3.4 臨床檢測結果 使用本研究建立的熒光定量PCR 方法對329 份正常豬血清進行檢測，得出PCV3陽性率為31.3%（103/329）。對56份流產胎兒、29 份精液、102 份唾液拭子進行檢測，得出陽性率分別為48.21%（27/56）、44.83%（13/29）、31.37%（32/102）。該結果表明PCV3 在四川省內規模化豬場廣泛存在，具有較高的流行率。

4 討論

PCV3 作為一種新型豬圓環病毒，自2016 年在美國被發現以來，陸續在中國、巴西、韓國等地區的豬場出現，如今在全世界范圍內已呈流行趨勢。有學者表示PCV3 或可垂直傳播，且與PMWS、PDNS、母豬繁殖障礙以及增生性壞死性間質性肺炎等疾病有關。值得注意的是，部分感染PCV3的豬只無臨床感染癥狀［4-5］。

本研究建立的熒光定量PCR 方法，特異性強、重復性好、靈敏度高，最低檢測值為7.87×101拷貝/μL，靈敏度高于李暢等［6］得出的129 拷貝數。張志等［7］建立的PCV3 熒光定量PCR 方法的組內及組間重復性試驗變異系數小于3%，而本試驗的變異系數均小于1%，可見本方法的重復性更好。目前PCV3 的病原學研究尚不明確，由于缺少適合PCV3繁殖的體外培養體系，對PCV3的分離培養比較困難，僅陳秋艷等［8］報道過通過PK15 細胞分離到PCV3 活毒株。后續可開展PCV3 的分離鑒定，為研究PCV3 的生物學特性、致病機制及疫苗研制等工作奠定基礎。■