超高效液相色譜-高分辨質譜測定白酒中氨基甲酸乙酯含量

熊曉通，胡 峰，尤小龍，尹艷艷，陳明學，程平言，鐘方達

（貴州茅臺酒廠（集團）習酒有限責任公司，貴州 習水 564622）

近年來，隨著醬酒熱的持續升溫，醬香型白酒也越來越受到消費者的青睞[1-2]。而氨基甲酸乙酯（ehthy carbamate，EC）作為醬香白酒發酵過程中產生的一種天然有害致癌物質[3]，在各種香型白酒中均普遍存在[4]，雖在白酒領域已取得了釀造過程中EC產生機理的研究成果[5-6]，并針對一些工藝環節實施了對EC含量的控制[7-8]，但因人工干預環節的有限性，仍然難以徹底杜絕EC的安全隱患[9]，并且根據國內外相關研究，白酒中的主要成分乙醇也會加大EC的致癌性[10]，故EC產生的食品安全風險隱患已成為白酒行業關注的熱點問題之一[11-14]。雖然國內暫未出臺EC的相關限量標準，但加拿大、捷克、法國等國家早已規定蒸餾烈酒中EC質量濃度不得超過150 μg/L[15-17]。

目前，薄層分析法[18]、液相色譜法[19]、氣相色譜分析法[20]、氣相色譜-串聯質譜法[21]、近紅外光譜法[22]等是常用的EC檢測方法。上述幾種方法存在樣品前處理過程繁瑣、需要消耗大量藥品和有機溶劑、基質干擾較大、樣品檢測效率不高等缺點，不利于人體健康、環境和檢測成本控制[23]。隨著檢測設備的不斷更新換代，新的檢測技術也被廣泛應用[24-25]，其中超高效液相色譜-高分辨質譜檢測技術檢測醬香白酒中EC含量時具有前處理方便快捷、基質效應較低、抗干擾能力強、分辨率高、靈敏度高、準確度高等優點，國內外相關文獻報道也并不多見[26-27]。因此，本研究擬建立醬香白酒中EC含量的超高效液相色譜-高分辨質譜一級子離子定量法，該方法旨在有效去除基質干擾，靈敏度高，檢測分析速度較快，在醬香白酒EC監控過程中取得良好效果。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

實驗酒樣為貴州茅臺酒廠（集團）習酒有限責任公司醬香成品酒以及市購醬香型白酒。

EC標準品（純度≥98.5%） 德國Dr. Ehrenstorfer公司；甲醇、甲酸（均為色譜純） 美國Fisher公司；實驗用水均為艾科浦超純水機制備的超純水。

1.2 儀器與設備

Q Exactive Focus高分辨質譜儀（配備可加熱電噴霧電離源） 美國Thermo公司；UltiMate 3000超高效液相色譜儀 美國Dionex公司；萬分之一電子天平美國Ohaus公司；BPG型精密鼓風干燥箱 上海一恒科學儀器有限公司；渦旋振蕩器 上海琪特分析儀器有限公司；全智能超純水機 美國艾科浦公司。

1.3 方法

1.3.1 標準溶液的配制

標準儲備液：稱取一定量EC標準品于100 mL容量瓶中，加水定容后配制成質量濃度為122 mg/L的標準儲備液，并放置于4 ℃冰箱中貯存待用。

標準系列溶液：準確量取1 mL標準儲備液于100 mL容量瓶中，加水定容后配制成質量濃度為1 220 μg/L的標準中間液，再逐級稀釋至12.2、36.6、61、122、244 μg/L的標準系列溶液，并放置于4 ℃冰箱中貯存，待用。

1.3.2 樣品前處理

標準系列溶液前處理：系列溶液過0.22 μm水相微孔濾膜后直接上機檢測。

酒樣前處理：準確吸取1 mL酒樣于離心管中，置于80 ℃烘箱中烘至0.2～0.4 mL后取出，冷卻后加水定容至1 mL，渦旋混勻，過0.22 μm水相微孔濾膜，上機檢測。

1.3.3 分析條件

1.3.3.1 色譜條件

色譜柱：Accucore aQ液相色譜柱（150 mm×2.1 mm，2.6 μm）；柱溫：35 ℃；流動相：A相為體積分數為0.1%甲酸溶液，B相為甲醇；進樣溫度：4 ℃；進樣體積：10 μL；洗脫方式：采用梯度洗脫（表1）。

表1 梯度洗脫程序Table 1 Gradient elution procedure

1.3.3.2 質譜條件

離子源：可加熱大氣壓電噴霧電離源，正離子掃描模式；掃描類型：選擇離子檢測模式；掃描范圍m/z55～95；分辨率70 000；自動增益控制目標離子數1×106；最大注入時間5 ms；鞘氣流速30 arb；輔助氣流速15 arb；噴霧電壓2.3 kV；離子傳輸管溫度350 ℃；S-lens RF evel：80；輔助氣加熱溫度200 ℃。

2 結果與分析

2.1 子離子的確定

王成龍等[28]以m/z62.02作為EC的定量子離子，運用高效液相色譜-高分辨質譜儀建立了平行反應監測二級子離子全掃描模式，對白酒中EC進行二級子離子定量。本研究運用一級全掃自動觸發二級模式對122 μg/L EC標準溶液進行數據采集，得到EC的一級母離子色譜圖（圖1），發現若采用一級母離子定量，其基質干擾較為嚴重，檢出限較高。EC母離子在高能量碰撞解離池中，被10 eV的碰撞能量打碎后，提取出EC的二級質譜圖（圖2），雖然m/z62.02的相對豐度最大，但響應值也只有1.78×104。在相同色譜條件下，運用平行反應監測二級子離子全掃描模式高能量碰撞解離池（碰撞能量為10 eV）對122 μg/L EC標準溶液進行數據采集，將圖2中離子進行逐個提峰，僅m/z62.02的離子所提取的峰（圖3）與圖1匹配效果較好，若采用二級子離子定量，雖消除了基質干擾，但其響應值較低，僅為5.24×104。

圖1 122 μg/L EC標準溶液一級母離子色譜圖Fig. 1 Primary parent ion chromatogram of EC standard solution at 122 μg/L

圖2 122 μg/L EC標準溶液二級質譜圖Fig. 2 Secondary mass spectrum of EC standard solution at 122 μg/L

圖3 122 μg/L EC標準溶液二級子離子色譜圖Fig. 3 Secondary daughter ion chromatogram of EC standard solution at 122 μg/L

圖4 EC母離子生成m/z 62.02離子模擬裂解圖Fig. 4 Simulated fragmentation of EC parent ions into m/z 62.02

據相關報道，m/z62.02的碎片離子為[EC＋H]+脫掉C2H4基團后形成的[29]，為進一步確認m/z62.02的碎片離子為EC的子離子，本研究使用Mass Frontier 7.0 軟件對EC母離子進行了模擬裂解，得到了生成m/z62.02離子的3 種可能途徑（圖4）。因此，m/z62.02的離子為EC的特征子離子，這與王成龍等[28]的研究報道一致。

2.2 質譜條件優化

為解決一級母離子定量基質干擾嚴重和二級子離子定量響應較低問題，本研究使用進樣針吸取一定量122 μg/L EC標準溶液（100 μL/min）與流動相（45%的A相、55%的B相，0.05 mL/min）通過三通閥混合后經離子源直接進質譜進行一級全掃，得到優化前的一級質譜圖（圖5A），發現EC出現源內裂解現象，同時出現m/z90.05的母離子以及m/z62.02的特征碎片子離子，這為EC一級子離子定量的可行性提供了依據。通過調節質譜參數以提高m/z62.02子離子的響應值，從而確定了最大注入時間、S-lens RF level兩個主要影響因素。通過降低最大注入時間和提高S-lens RF level參數可明顯增加子離子的響應值，其余參數均使用儀器默認值或廠家推薦值，從而確定1.3.3.2節優化后的質譜條件，繼而得到優化后的一級質譜圖（圖5B）。其中m/z62.02子離子優化前的響應值為4.52×105，經優化后變為1.50×106，提高了2.32 倍。相較于二級掃描模式下，m/z62.02子離子響應值提升了2 個數量級。

圖5 EC質譜條件優化前（A）、后（B）一級質譜圖Fig. 5 Primary mass spectra of EC before (A) and after (B)optimization of mass spectral conditions

2.3 色譜條件選擇

采用1.3.3.2節的質譜參數，在0.1%甲酸溶液-甲醇的流動相體系下，分別考察SyncronisHilic色譜柱（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）、Hypersil GOLD Amino色譜柱（150 mm×2.1 mm，3 μm）以及Accucore aQ色譜柱（150 mm×2.1 mm，2.6 μm）對EC分離效果的影響（圖6）。結果表明，同一濃度EC標準溶液在SyncronisHilic柱中出峰時間為1.13 min，保留時間較短，容易受基質干擾影響。在Hypersil GOLD Amino柱中雖有一定保留，但響應值較低，靈敏度不高。在Accucore aQ柱中不僅保留時間較長，響應值也較高，取得較好的分析效果。因此，選擇Accucore aQ色譜柱作為分析柱。

圖6 不同色譜柱下122 μg/L EC標準溶液一級子離子色譜圖Fig. 6 Primary daughter ion chromatograms of EC standard solution at 122 μg/L using different columns

2.4 方法評價

2.4.1 線性范圍、檢出限和定量限

本實驗根據醬香白酒中EC的實際含量確定1.3.1節中的標準系列溶液，按1.3.3節的分析條件對標準系列溶液進行上機檢測，以EC質量濃度為橫坐標（X），峰面積為縱坐標（Y）進行線性擬合，得標準曲線方程：Y=3 788.24＋67 210X，R2=0.999 5，線性范圍12.2～244 μg/L。以信噪比為3和10分別確定方法的檢出限和定量限，檢出限為0.95 μg/L，定量限為3.17 μg/L。

2.4.2 回收率和精密度實驗結果

分別選取38%、42%、53%的醬香型白酒，加標量為10、50、100 μg/L，在1.3.3節分析條件下，對加標樣品進行前處理后上機檢測。每個加標樣品做6 次平行實驗，計算樣品回收率和相對標準偏差（relative standard deviation，RSD），不同乙醇體積分數的醬香型白酒加標回收率在83.46%～106.79%之間；對此方法的精密度進行考察，其中EC測定結果RSD為0.67%～3.54%，均小于5%，完全符合方法精密度要求，結果如表2所示。

表2 不同乙醇體積分數醬香型白酒加標回收率和RSD（n=6）Table 2 Recoveries and relative standard deviation of EC in spiked Maotai-flavor Baijiu with different alcohol contents (n= 6)

2.5 實際樣品的測定結果

選取不同品牌市售的53%醬香型白酒進行分析檢測，每個酒樣重復檢測6 次，均不同程度檢出了EC，平均質量濃度為105.25 μg/L，測定結果RSD均小于5%，結果如表3所示。

表3 不同品牌醬香型白酒中EC含量（n=6）Table 3 EC contents in different brands of Maotai-flavor Baijiu (n= 6)

3 結 論

本研究運用EC在高分辨質譜儀一級全掃模式下出現源內裂解的性質，建立了檢測醬香型白酒中EC含量的超高效液相色譜-高分辨質譜一級子離子定量法。該方法不僅解決了一級母離子定量基質干擾嚴重、檢出限較高的問題，還克服了二級子離子定量響應較低的難題。方法前處理也相對簡單，酒樣僅需烘箱內揮發除乙醇后定容即可，測定過程在10 min內便可完成，具有分析速度快、響應值高、準確度高等優點。醬香型白酒餾酒溫度高，部分產品尤其是高端產品中EC含量較低[30-31]，本方法檢出限為0.95 μg/L，定量限為3.17 μg/L，可以滿足應用于EC含量較低的醬香型白酒產品EC的定量測定，最大限度降低EC產生的食品安全風險，同時高效便捷的實驗步驟可實現醬香型白酒產品中EC的大量檢測。