適配體結合量子點技術同時檢測金黃色葡萄球菌和大腸埃希氏菌O157:H7方法

王 玥，邵 琳，李乾學，易 樂，曲 晗，王洪利，沈明浩,*

（1.吉林農業大學食品科學與工程學院，吉林 長春 130118；2.軍事科學院軍事醫學研究院軍事獸醫研究所，吉林 長春 130122；3.長春理工大學，吉林 長春 130022）

大腸埃希氏菌O157:H7是腸出血性大腸埃希氏菌的主要血清型，其致病力強，能引起人類出血性腹瀉和溶血性尿毒綜合癥以及血栓性血小板減少性紫癜等[1-2]。該病已被世界衛生組織列為新的食源性疾病，是導致食源性疾病的主要致病菌之一[3]。此外，據美國疾病控制中心報告，在美國由金黃色葡萄球菌引起的食物中毒數量僅次于大腸埃希氏菌，居第2位，占細菌性食物中毒的33%[4-5]，在我國的細菌性食物中毒事件中，由金黃色葡萄球菌引起的食物中毒占1/4[6]。近年來，由以上2 種菌引起的食物中毒有明顯上升趨勢，建立一種快速、特異性強、簡便的檢測大腸埃希氏菌O157:H7和金黃色葡萄球菌的方法是當務之急。

近年來，由于適配體和抗體相比在親和力和特異性方面都有更顯著優勢。應用體外篩選適配體技術[7]結合表面增強拉曼光譜（surface-enhanced Raman spectroscopy，SERS）技術[8-9]進行食源性致病菌的檢測方法具有篩選周期短、特異性及穩定性高、方便快捷等優點，已成為近年來細菌檢測領域的研究熱門[10-11]。該方法應用廣泛，如在生物醫藥領域已檢測DNA[12]、細胞[13-14]、葡萄糖[15]等，尤其是Smolsky[16]、Roy[17]等在生物傳感器、新藥研發、臨床診治等領域的研究尤為突出。在食品領域主要是針對食品添加劑、抗生素殘留[18]以及病原微生物[19]等食物中存在的污染物進行檢測。而隨著新型納米材料的不斷興起，量子點技術在快速檢測方面的應用逐漸突顯出來，這主要是由于量子點具有光學信號強、熒光量子產率高[20-21]、尺寸可調、光學性質穩定等特點，可與生物材料附加進而實現樣本的快速定量檢測[22]。

本研究利用2 種致病菌的適配體與納米磁珠共價結合的技術，形成能夠特異性吸附目標病原菌的免疫磁性顆粒[23]。同時將鏈霉親和素量子點標記到特異性適配體上；在富集過程中，免疫磁球、目標致病菌和免疫量子點形成一個“三明治結構”復合物（適配體功能化磁球-細菌-適配體功能化量子點）；利用熒光光譜法和熒光顯微技術考察量子點熒光強度中致病菌的生長情況，最后應用到市售無菌牛乳實際樣品中進行加標回收率實驗。該技術高效、靈敏，有望在食品相關領域得到廣泛應用。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

袋裝全脂滅菌純牛乳（240 mL/袋） 市購。

金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureusCICC:21600）、大腸埃希氏菌O157:H7（Escherichia coliCICC:21530） 中國工業微生物菌種保藏中心（China Center of Industrial Culture Collertion，CICC）；生物素化金黃色葡萄球菌適配體[24]（序列：5′-TCCCT ACGGC GCTAA CCTCC CAACC GCTCC ACCCT GCCTC CGCCT CGCCA CCGTG CTACA AC-3′）、生物素化大腸埃希氏菌O157:H7適配體[25]（序列：5′-AAAAC CGCAT TTATG CTCAG CGATA CTACG CGCGC GTCC TCGAG CGACG CGGAT-3′）合成于吉林省庫美生物科技有限公司（100 μmol/L），記為aptS和aptE；鏈霉親和素的量子點（quantum dots，QDs；發射波長525 nm-QDs525，發射波長605 nm-QDs605）（1.01 μmol/L，100 μL）（本實驗記為QDs605和QDs525） 武漢珈源量子點技術開發有限責任公司；鏈霉親和素納米磁珠BeaverBeadsTMStreptavidin（IMB）（25 μm，50 mg/mL） 蘇州Beaver公司；磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered solution，PBS） 美國Hyclone公司；肉湯液體培養基（胰蛋白胨10 g/L、酵母提取物5 g/L、氯化鈉10 g/mL，pH 7.4，LB液體培養基）；瓊脂糖 鼎國生物工程公司；1×緩沖溶液（Binding Buffer，1×BB；50 mmol/L，Tris-HCl，5 mmol/L KCl，100 mmol/L NaCl，1 mmol/L MgCl2，pH 8.2）；牛血清白蛋白、99.999% AgNO3德國Sigma Aldrich Taufkirchen公司。

1.2 儀器與設備

DynaMagTM-2 Magent磁力架 賽默飛世爾科技（中國）有限公司；AB204-S電子天平 梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；LDZ5-2水平離心機 北京雷勃爾離心機有限公司；BSC-1300 II A2生物安全柜 蘇州凈化公司；LabRAM HR Evolution拉曼光譜儀 法國Horiba Scientific公司；ZWYR-204恒溫水平搖床、LS-55 Perkin Elmer熒光分光光度計 上海智成分析儀器制造有限公司；IX73倒置熒光顯微鏡 北京奧林巴斯（中國）有限公司。

1.3 方法

1.3.1 菌懸液的制備及保存

取冷凍保存的金黃色葡萄球菌、大腸埃希氏菌各20 μL，分別加入5 mL肉湯液體培養基中，搖床過夜（37 ℃、200 r/min、離心半徑10 cm）。所得細菌置于平板上進行接種后，倒轉平板，37 ℃恒溫箱內培養24 h并計數，得到108CFU/mL菌液濃度。5 000 r/min離心2 min收集菌液，棄上清液，用1×BB清洗2 次，去除多余的培養基成分。新鮮LB液體培養基重懸至濃度為107CFU/mL，4 ℃保存備用。

1.3.2 適配體與目標菌結合特異性分析

1.3.2.1 金黃色葡萄球菌適配體特異性測定

將aptS稀釋至500 nmol/L，利用聚合酶鏈式反應儀進行折疊：95 ℃變性2 min，然后以2 ℃/40 s的速率冷卻至37 ℃，4 ℃保存備用。取稀釋為107CFU/mL濃度2 種菌液（S. aureus、E. coli）各1 000 μL，分別置于1.5 mL離心管中，順次加入折疊后aptS，混合均勻后向離心管內加入100 μL AgNO3溶液（0.1 mmol/L），充分混勻，避光孵育5 min，順次加入100 μL NaBH4溶液（0.1 mmol/L），混勻，離心處理（3 000 r/min，瞬離5 s），棄上清液，留沉淀加入200 μL去離子水復溶，即得金黃色葡萄球菌適配體特異性待測樣品，記為S. aureus-aptS@AgNP和E. coliaptS@AgNP。4 ℃保存備用。

1.3.2.2 大腸埃希氏菌適配體特異性測定

大腸埃希氏菌適配體特異性檢測樣品制備步驟同上。取aptE，所得樣品記為E. coli-aptE@AgNP、S. aureus-aptE@AgNP。4 ℃保存備用。進行表面增強拉曼光譜檢測，首先使用硅片在基準峰（520.7 cm-1）處對儀器進行校準。隨后取待測樣品4 μL，滴至石英載玻片正中心凹槽內，對樣品峰值采集時使用632.8 nm氦氖激光，在激光強度14 mW，物鏡50 倍條件下，設置積分時間2 s，積分次數5 次，分辨率1 cm-1，狹縫寬度100 μm，掃描范圍500～2 000 cm-1，利用Origin 9.1進行終數據處理。

1.3.3 適配體功能化的磁珠制備及結構表征

取鏈霉親和素磁珠100 μL于1.5 mL離心管中，磁性分離，PBS清洗2 次，吸棄上清液，用PBS復溶至1 000 μL體系，平均加到2 個離心管內。分別選取2 種已折疊適配體500 μL加入到500 μL的磁珠（10 mg/mL）中，輕微振蕩反應30 min，通過外加磁場，磁性分離去除游離的適配體，加入1%牛血清白蛋白封閉磁珠表面未結合的位點，振蕩孵育1 h，最后PBS清洗2 次，去離子水復溶至200 μL。將所得適配體功能化的納米磁珠記為IMB-aptS、IMB-aptE。取2 種備用目標菌液各800 μL，分別與功能化磁珠混合，室溫孵育45 min，磁性分離清洗，得到樣品S. aureus-IMB-aptS、E. coli-IMB-aptE。通過掃描電鏡觀察其結合狀態。

1.3.4 量子點顯微成像及其功能化

分別取2 種量子點原液各5 μL滴在載玻片正中心，靜置待干后通過倒置熒光顯微鏡觀察其激發后的顏色、形態以及發射波長。取QDs605、QDs525各10 μL于離心管中，分別加入90 μL純水制得10 倍稀釋的量子點溶液。向量子點QDs605中加入500 μL折疊后aptS，向量子點QDs525中加入500 μL折疊后aptE，混合均勻后在室溫條件下以15 r/min振蕩孵育45 min，得到2 種功能化量子點記為QDs605-aptS、QDs525-aptE，4 ℃備用。

1.3.5 “三明治結構”表征

將樣品IMB-aptS-S. aureus與QDs605-aptS混勻孵育2 h，清洗得到金黃色葡萄球菌“三明治結構”復合物樣品記為IMB-S. aureus-QDs605，大腸埃希氏菌樣品記為IMB-E. coli-QDs525，步驟同上。將上述樣品置于倒置熒光顯微鏡下，通過觀察細菌在明暗場條件下的不同狀態，確定熒光標記是否成功。取2 種目標菌液各1 000 μL（共2 000 μL）混勻，3 000 r/min離心5 min清洗得到混合菌液沉淀，分別與2 種功能化量子點和磁珠混勻孵育得到混合菌液的“三明治結構”復合物，通過流式細胞儀FL1通道與FL2通道能夠吸收不同熒光物質的原理，達到單獨和同步檢測2 種目標菌的結果。

1.3.6 對“三明治結構”捕獲條件優化

1.3.6.1 適配體濃度優化

取適配體（100 μmol/L）分別稀釋為100、200、300、400、500、600 nmol/L 6 個濃度，取稀釋后濃度適配體各200 μL分別置于6 支離心管內，進行折疊處理。取60 μL磁珠原液，磁性吸附，PBS清洗3 次，沉淀用600 μL PBS定容后，分別取100 μL體積加到折疊后6 個濃度的適配體中，室溫振蕩孵育30 min，隨后步驟同1.3.3節，得到6 份樣品IMB-apt100～IMB-apt600。取備用菌液于6 支離心管內各800 μL，離心2 次（3 000 r/min、5 min），棄去上清液。對應加入6 份不同濃度IMB-apt樣品，充分混勻后，振蕩孵育1 h，隨即取出進行磁性分離，PBS清洗2 次，去離子水清洗1 次，得到6 份樣品IMB-apt100-目標菌（OTA）～IMB-apt600-OTA，備用。同步進行6 份功能化量子點制備（方法步驟同1.3.4節），將制得的功能化量子點與不同適配體濃度的6 份樣品IMB-apt100-OTA～IMB-apt600-OTA充分混勻，室溫孵育2 h，期間保持振蕩。隨后取6 份樣品5 000 r/min離心2 min，PBS清洗2 次，去離子水清洗1 次，沉淀用600 μL去離子水定容、待檢。

1.3.6.2 捕獲時間優化

取優化后適配體最適濃度，按1.3.6.1節步驟制備2 種IMB-apt-OTA樣品，室溫孵育條件下的振蕩時間分別選取30、45、60、75 min，同時加入陽性對照菌液，將所得樣品與陽性對照重懸后分別取100 μL進行平板計數，計算捕獲效率：

式中：Nc為捕獲得到的細菌數/（CFU/mL）；N0為原始的細菌數/（CFU/mL）。

1.3.6.3 磁性分離時間優化

按1.3.6.2節步驟制備2 種IMB-apt-OTA樣品，選取最適捕獲時間，磁性分離時間分別選取1、2、3、4、5、6 min后對所得樣品及其陽性對照進行平板菌落計數，計算捕獲效率。

1.3.7 同步檢測2 種目標菌并確定其檢出限

對混合菌進行10 倍濃度梯度稀釋（106、105、104、103、102、101）得到6 份不同濃度的混合菌液，離心清洗，沉淀待用。結合以上優化條件，按1.3.3節步驟制備IMB-aptS、IMB-aptE樣品各6 份，每份200 μL，分別與6 份菌沉淀混勻，振蕩孵育1 h，5 000 r/min離心2 min，PBS清洗后留混合樣品沉淀。按1.3.4節制備QDs605-aptS、QDs525-aptE樣品各6 份，每份500 μL，與所得6 份混合樣品沉淀混勻，室溫孵育2 h，5 000 r/min離心2 min，清洗，得到6 份不同濃度混合菌液的“三明治結構”復合物樣品，600 μL體系定容。將上述樣品通過熒光分光光度計檢測，并提取不同濃度目標菌的熒光強度曲線，確定檢出限，擬合線性關系并建立標準曲線。

1.3.8 牛乳樣品中金黃色葡萄球菌及大腸埃希氏菌O157:H7加標回收實驗

取新鮮LB液體培養加入瓊脂粉15 g，加入1 L去離子水同時攪拌混勻，調節pH值至7.2±0.2，高壓滅菌，倒入平板培養皿內冷卻，4 ℃保存備用。取購買的市售無菌牛乳添加混合菌配制成不同濃度的菌液樣品，隨后10 000 r/min離心8 min，去除上層乳脂，沉淀用去離子水稀釋20 倍，靜置30 min后濾出上層清液分裝在離心管內，利用本實驗建立的方法進行檢測，得到結果與傳統平板計數法相比較，并計算其回收率。

2 結果與分析

2.1 適配體特異性分析

如圖1A所示，S. aureus-aptS@AgNP光譜的信號強度明顯，隨后在15 min內針對S. aureus-aptS@AgNP進行10 次隨機檢測，結果如圖1B所示，該譜圖吻合度極高，重復性良好。圖1C為大腸埃希氏菌O157:H7適配體特異性結果，E. coli-aptE@AgNP光譜的峰值信號強度比S. aureus-aptE@AgNP明顯，圖1D為樣品重復性檢測，表明結果穩定可靠。

圖1 適配體與目標菌特異性分析Fig. 1 Specificity analysis of aptamers for the target bacteria

2.2 適配體功能化磁珠制備及結構表征

圖2 適配體功能化磁珠制備及結構表征Fig. 2 Preparation and structural characterization of aptamer functionalized magnetic beads

圖2 A為鏈霉親和素納米磁珠的掃描電鏡照片，可以看出該磁珠形態清晰，大小一致。圖2B為樣品S. aureus-IMB-aptS，圖2C為樣品E. coli-IMB-aptE的掃描電鏡照片。其中明顯看出磁珠周圍富集了大量目標菌，且分散均勻，結合緊密。

2.3 量子點顯微成像及其功能化表征

圖3A為2 種量子點QDs605和QDs525在熒光分光光度計激發光源下所呈現的熒光光譜圖；圖3B與圖3C為QDs605和QDs525原液在倒置熒光顯微鏡下成像圖。該結果表明被激發光激發后的QDs605呈現綠色熒光，QDs525呈現橙色熒光。

圖3 量子點顯微成像及其功能化表征Fig. 3 Microscopic imaging of quantum dot and its functional characterization

2.4 “三明治結構”表征

圖4 三明治結構的熒光顯微成像Fig. 4 Fluorescence microscopy images of the sandwich structure

圖4 A、B為標記有QDs605的金黃色葡萄球菌“三明治結構”在倒置熒光顯微鏡下的圖像。可以清晰地觀察到金黃色葡萄球菌在明、暗場條件下的形態大小都保持一致，并且在暗場條件下通過熒光標記的金黃色葡萄球菌被激發出綠色熒光；圖4C、D為標記有QDs525的大腸埃希氏菌“三明治結構”，可以看到在明暗場之中都保持一致的細菌形態，在暗場下通過熒光標記的大腸埃希氏菌呈現橙紅色熒光。

結合流式細胞術對單獨識別目標菌和同步檢測2 種目標菌的“三明治結構”的驗證，如圖5所示，其中圖5A為對照組的混合菌液未標記熒光信號出現在陰性區。圖5B是標記有QDs605的金黃色葡萄球菌“三明治結構”在綠色熒光FL2-H通道的陽性區域內出現。圖5C是標記有QDs525的大腸埃希氏菌“三明治結構”在橙紅色熒光FL1-H通道的陽性區域內出現。圖5D是分別標記QDs605和QDs525混合菌液的“三明治結構”，分別在FL1-H，FL2-H通道內的陽性區域出現，證明同步檢測2 種目標菌的方法驗證成功。

圖5 流式細胞分析圖Fig. 5 Flow cytometric analysis

2.5 對“三明治結構”捕獲條件優化

2.5.1 適配體濃度優化

圖6 “三明治結構”捕獲條件優化Fig. 6 Optimization of sandwich structure capture conditions

分別選取100、200、300、400、500、600 nmol/L 6 個適配體濃度，通過熒光分光光度計在不同適配體濃度下所激發出不同的熒光強度進行譜圖繪制。圖6A、B分別為金黃色葡萄球菌與大腸埃希氏菌適配體濃度優化結果。結果表明適配體濃度為400 nmol/L時混合樣品熒光強度均達到最高。最終選取400 nmol/L為2 種適配體在“三明治結構”中的最適濃度。

2.5.2 捕獲時間優化

如圖6C所示，捕獲時間30～45 min內，2 種細菌的捕獲效率隨時間延長逐漸增大。當捕獲時間為45～50 min時，磁珠的捕獲效率相對較高。隨后50～75 min內捕獲效率緩慢下降。綜上，最佳捕獲時間為45 min。

2.5.3 磁性分離時間優化

從圖6D可以看出，磁分離時間在1～2 min以內，捕獲效率隨時間而提高。當磁性分離時間為2 min，磁珠捕獲目標細菌相對最有效，隨后捕獲效率在磁性分離時間2～6 min內持續下降。因此，最佳磁分離時間選擇2 min。

2.6 同步檢測2 種目標菌并確定其檢出限

在450 nm激發波長條件下對混合菌液的“三明治結構”進行熒光強度的測定，此時混合菌液濃度梯度為106、105、104、103、102、101CFU/mL。由圖7A可知，金黃色葡萄球菌混合菌液中檢出限為101CFU/mL，由圖7B可知，大腸埃希氏菌在混合菌液中的檢出限為102CFU/mL。

圖7 同步檢測2 種目標菌檢出限Fig. 7 Detection limits for simultaneous detection of two target bacteria

如圖8所示，以其細菌菌落數的對數值為橫坐標，熒光強度值為縱坐標，得到線性關系。其中，金黃色葡萄球菌線性方程為Y=28.51X＋126.67，R2=0.973；大腸埃希氏菌線性方程為Y=92.86X-64.67，R2=0.987。結果表明針對2 種菌的目標檢測均呈現良好遞增趨勢。

圖8 細菌菌落數的對數值與熒光強度的線性關系Fig. 8 Linear relationship between logarithmic bacterial colony number and fluorescence intensity

2.7 牛乳樣品中金黃色葡萄球菌及大腸埃希氏菌O157:H7加標回收實驗

表1 牛乳樣品中金黃色葡萄球菌及大腸埃希氏菌O157:H7的檢測回收率Table 1 Recoveries of S. aureus and E. coli spiked in milk samples

如表1所示，金黃色葡萄球菌的檢測回收率在94.6%～102.8%之間，大腸埃希氏菌O157:H7回收率在93.4%～100.4%之間，所得回收率良好。由此證明與傳統平板計數法相比，本實驗所建立的檢測方法的一致性良好，可以應用于實際樣品中致病菌的檢測。

3 討 論

近年來基于適配體的快檢技術在生物和食品領域得到了急速的發展，這主要是基于適配體對pH值、溫度等環境因素較不敏感，生產成本低[26]，且與抗體比較具有對目標細菌更佳的特異性，因此有潛力成為抗體的替代品[27-28]。在食源性致病菌的檢測中同時實現對多種目標菌的快速檢測具有積極的現實意義，對食品安全領域具有很大的需求和發展潛力。但目前基于適配體技術對目標菌的快檢應用還存在很多問題，其根本原因是適配體的親和力和特異性問題，以及檢測靈敏度問題而無法實現對生產現場的實際應用[29]。

本研究所建立方法的取決于金黃色葡萄球菌的適配體與其特異性結合能力以及大腸埃希氏菌O157:H7的適配體與其特異性結合能力。基于本研究所建立的金黃色葡萄球菌和大腸埃希氏菌O157:H7的“三明治結構”的模式分別為IMB-S. aureus-QDs605和IMB-E. coli-QDs525，觀察熒光信號的變化結果顯示由目標菌種引起的熒光信號的改變非常顯著，該結果證明了基于適配體結合量子點的熒光標記技術分析檢測金黃色葡萄球菌和大腸埃希氏菌O157:H7的方法具有高度特異性。本研究不僅對“三明治結構”中的適配體濃度進行優化，還對2 種目標菌的捕獲時間和磁性分離時間進行優化，使金黃色葡萄球菌和大腸埃希氏菌O157:H7的捕獲效率達到90%左右。實現對“三明治結構”完整的評價和改良，大大提高了本方法的檢測效率。同時檢測2 種目標細菌的結果表明，金黃色葡萄球菌與熒光強度在101～106CFU/mL的范圍內線性相關：R2=0.973，檢出限為101CFU/mL。大腸埃希氏菌O157:H7與熒光強度在101～106CFU/mL范圍內線性相關：R2=0.987，檢出限為102CFU/mL。此研究可證明，在短時間內建立適配體結合量子點技術的“三明治結構”可以對2 種食源性致病菌在101～106CFU/mL濃度范圍內進行同時分離富集和定量檢測，向市售無菌的牛乳樣品中加入金黃色葡萄球菌和大腸埃希氏菌O157:H7，利用本研究的新方法與傳統平板法進行回收率實驗比較結果表明所建立方法準確度良好，可適用于實際樣品的檢測，顯示該技術在致病微生物多元檢測的現場也具有極大的應用潛力。

4 結 論

本研究利用適配體結合量子點技術建立了可以同時檢測金黃色葡萄球菌和大腸埃希氏菌O157:H7的“三明治結構”，該方法特異性強、檢測靈敏度較高，縮短了2 種食源性致病菌的檢測時間，減小了檢測難度。且可實現牛乳樣品的快速檢測，為同時檢測由上述2 種食源性致病菌污染牛乳引起的食物中毒提供可靠技術支持。