貴州銅仁梵凈山地區綠茶的產地溯源

張明露，黃聰薇，黎禮科，肖一璇，余海游，趙泰然，尹 杰,*

（1.貴州大學茶學院，貴州 貴陽 550025；2.中國農業科學院茶葉研究所，農業農村部茶葉產品質量安全風險評估實驗室，浙江 杭州 310008；3.貴州省農業農村廳，貴州 貴陽 550025；4.貴州省銅仁市農業農村局，貴州 銅仁 554300）

茶葉中含有多種礦質元素，對茶樹生長發育和維持人體正常生命活動具有舉足輕重的作用[1]。但是，由于不同茶樹種植區土壤中元素的組成和含量，受當地地質條件、種植管理和加工方式等多種因素影響，加之茶樹對土壤中元素吸收和富集具有選擇性，使茶葉中的元素含量具有一定的地域差異[2]。隨著環境污染加劇，化肥、農藥使用不合理、加工機械合金材料的選擇以及加工過程未實現清潔化生產等，有毒有害的重金屬元素如Pb、As、Cr、Co和稀土元素的污染對茶葉質量安全帶來的風險引起廣泛關注[3-4]。因此，通過分析茶葉中元素組成和含量，有利于該地茶葉質量安全和品質評價，了解該產地茶樹種植土壤條件和產地特征，對該地區茶樹施肥用藥、茶葉營養價值和飲用安全具有理論指導意義，同時，小范圍產地區域的精細判別也為茶葉質量安全生產追溯提供一定的方法支持。

章劍揚等[4]對浙江省十大名茶樣品中稀土元素、As、Cr、Cd和Pb含量進行測定，并對不同茶類間各元素含量差異和各重金屬含量之間的關系進行分析，結果表明，所有樣品中主要重金屬含量未超出國家相關限量標準，Cr、Cd、Pb和稀土元素含量在各類茶中差異顯著。呂海鵬等[5]分析4 個不同產地和不同等級的7 個曬青毛茶和25 個普洱茶中16 種礦質元素，其中，Na、K、Ca、Zn、Mn、Fe、Al、Mg、Ni和Co共10 種礦質元素在普洱茶中含量顯著高于曬青毛茶，不同產地普洱茶中K、S、Ca、Fe、Al、Mg、Ni和Co含量差異顯著，不同等級的普洱茶中礦質元素含量則無顯著差異。但是，董喆等[6]通過測定不同季節、不同嫩度的信陽毛尖中8 種礦質元素含量，認為不同等級的信陽毛尖中礦質元素含量具有一定差異性，通過主成分分析（principal components analysis，PCA）法分析其與茶葉品質的關系，構建可客觀評價信陽毛尖茶葉質量的模型。同時，電感耦合等離子體質譜（inductively coupled plasma mass spectrometry，ICP-MS）分析法因具有快速、高效、檢出限低等優點，較廣泛應用于茶葉[7-9]、中藥材[10]、啤酒花[11-12]、葡萄酒[13-14]、花椒[15-16]、乳制品[17]和肉類食品[18]等產品中礦質元素的檢測。

貴州省是全國茶園面積最大的省份，截止2019年底，全省茶園面積達700萬 畝，其中銅仁市位于貴州省東北部，地處我國武陵山區，是貴州省茶葉主產區之一，江口、思南、石阡、沿河等主產縣茶園面積達158萬 畝，位居貴州省第二，產量約占全省30%。對該市茶葉中微量元素的檢測及小范圍區域產區精細判別，有助于了解全省茶葉質量安全現狀和開展全省茶葉產地追溯可行性的研究。

因此，本實驗采用ICP-MS測定銅仁市4 個主產縣（江口縣、石阡縣、思南縣、沿河縣）所產42 個綠茶茶樣中31 種微量元素含量，結合相關性分析、PCA、逐步線性判別分析（stepwise linear discriminant analysis，S-LDA）和正交偏最小二乘-判別分析（orthogonal partial least squares-discriminant analysis，OPLS-DA）等方法，以期為該地茶葉質量安全性、茶園肥培管理和小區域產地溯源等提供科學理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

共采集貴州省銅仁市4 個茶葉主產縣42 個綠茶茶樣（表1），所有茶樣均為2019年市售春茶，基本工藝流程為鮮葉-殺青-揉捻-（做形）-干燥。茶樣均在0 ℃條件下密封貯存。

表1 采集地相關信息和樣品數Table 1 Information about tea samples collected in this study

重金屬元素單標鉻（Cr）、鈷（Co）、硒（Se）、鉬（Mo）、銀（Ag）、鋇（Ba）、鎳（Ni）、銅（Cu）、砷（As）、鐵（Fe）、鉛（Pb）、鋅（Zn）、鋁（Al）和錳（Mn），稀土元素單標鈧（Sc）、釔（Y）、鑭（La）、鈰（Ce）、鐠（Pr）、釹（Nd）、釤（Sm）、銪（Eu）、釓（Gd）、鋱（Tb）、鏑（Dy）、鈥（Ho）、鉺（Er）、銩（Tm）、鐿（Yb）、镥（Lu） 國家有色金屬及電子材料分析測試中心；含有鎘（Cd）混合標液、內標 美國Sigma公司；硝酸（分析純） 國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

X-Series 2 ICP-MS儀 美國賽默飛世爾科技公司；MARS X-Press型微波消解儀 美國CEM公司；BHW-09C趕酸器 成都英泰爾科技有限公司；超純水系統美國Millipore公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品前處理

將茶樣充分磨碎，稱取0.400 g置于聚四氟乙烯微波消解管中，加入5 mL 15.2 mol/L HNO3溶液，放入微波消解儀，在180 ℃條件下消解40 min，然后在趕酸器上加熱趕酸至約1 mL，冷卻后以0.3 mol/L硝酸溶液將樣品轉移定容至25 mL，空白樣品同法處理。每個樣品做3 個平行。

1.3.2 儀器參數

ICP-MS工作條件：射頻功率1 290 W；載氣流速、輔助氣流速和補助流速分別為1.0、0.98 L/min和1.0 L/min；采樣深度8.0 mm；數據采集模式為跳峰模式；積分時間0.01 s；重復采集數據3 次。

1.4 數據處理

利用SPSS 20.0統計分析軟件進行方差分析、相關性分析和S-LDA；SIMCA-P 14.1軟件進行PCA和OPLS-DA。

2 結果與分析

2.1 銅仁市綠茶茶樣中微量元素含量分析

2.1.1 15 種微量元素含量分析

表2 銅仁市綠茶中微量元素含量Table 2 Microelements contents of green tea samples collected from different producing regions

如表2所示，比較各產區茶樣中15 種微量元素平均含量，其中，Al、Mn、Fe、Zn等元素含量較高，平均含量分別為707.69、646.80、143.96、50.54 mg/kg。茶樹是一種典型的富鋁植物，Al可以促進茶樹的光合作用和生長發育、參與兒茶素類物質的合成、影響其他元素的吸收和利用等[1]，但含量過高對人體健康具有一定的威脅。目前不同產地、不同茶類中Al的平均含量為175.75～2 028.60 mg/kg[2,19-20]，相比較，銅仁地區茶葉中Al含量屬于中等水平，但各產區之間含量差異較大。Mn、Fe和Zn不僅參與茶樹很多生理代謝過程，而且在人體維持新陳代謝、機體功能和提高免疫力等方面起著重要作用。與山東[21-22]、河南信陽[6]、江蘇[8]和浙江泰順[23]等產地所產綠茶中元素含量相比，貴州銅仁樣品中Zn含量較高，Mn和Fe含量屬中等水平；與貴州省內安順、黔東南州雷山、黔西南州和遵義等地所產綠茶相比[24-25]，Fe含量較高，Mn含量較低，Zn含量居中。除此之外，所測茶樣中還含有Cu、Ni、Co、Cr、Se、Mo等人體必需微量元素。

對所有茶樣中Cd、Pb、As、Cr和Cu等重金屬進行測定分析后發現，Pb含量范圍為0.22～0.34 mg/kg，遠低于GB 2762—2017《食品中污染物限量》[26]對茶葉中Pb的限量標準（≤5.0 mg/kg）；Cr、Cd和As含量范圍分別為0.36～0.67、0.032～0.083 mg/kg和0.047～0.063 mg/kg，均符合農業部相關限量標準（NY 659—2003《茶葉中鉻、鎘、汞、砷及氟化物限量》）[27]要求（Cr限量標準≤5.0 mg/kg、Cd限量標準≤1.0 mg/kg和As限量標準≤2.0 mg/kg）。Cu含量范圍為13.16～14.68 mg/kg，滿足農業部規定有機茶限量（NY/T 288—2018《綠色食品 茶葉》）[28]中Cu的限量標準（≤30.0 mg/kg）。

統計分析結果表明，Cr、As、Se、Ba、Pb、Fe、Ni、Cu和Mn元素含量在各產區之間無顯著性差異（P＞0.05），其余6 種元素（Co、Mo、Ag、Cd、Zn和Al）含量在不同產區茶樣之間差異顯著（P＜0.05）。其中，Co和Mo含量由高到低依次為思南縣、石阡縣、沿河縣、江口縣，Mo的最高含量與最低含量間相差21.51 倍；Ag含量則為江口縣＞沿河縣＞思南縣＞石阡縣，江口縣樣品中的平均含量與石阡縣樣品中的平均含量相差6.5 倍；Cd含量依次為思南縣＞沿河縣＞石阡縣＞江口縣；Zn含量為江口縣＞石阡縣＞沿河縣＞思南縣；Al含量則為思南縣＞江口縣＞石阡縣＞沿河縣。

2.1.2 稀土元素含量分析

表3 銅仁市綠茶中稀土元素含量Table 3 Rare element contents of green tea samples collected from different producing regions

從表3可知，42 個綠茶茶樣中各稀土元素含量范圍為0.001～0.118 mg/kg，各稀土元素總量由高到低分別為Ce、La、Y、Nd、Sc、Pr、Gd、Sm、Dy、Eu、Er、Yb、Ho、Tb、Tm和Lu，表明茶樹對稀土富集具有選擇性，以Ce、La、Y、Nd和Sc積累為主，與王雪萍[29]、方志清[30]等的研究結果一致。4 個產地茶樣中稀土總含量為1.36 mg/kg，與冉登培等[24]檢測結果相近（1.442 mg/kg），從高到低分別為沿河縣、思南縣、石阡縣和江口縣，其中，江口縣、石阡縣和思南縣的茶樣中未檢測出Tm和Lu元素，同時，江口縣的茶樣也未檢測出Tb元素。統計分析表明，Ce、La和Eu元素在各產區茶樣之間不存在顯著差異（P＞0.05），其余13 種稀土元素含量在不同產區茶樣之間差異顯著（P＜0.05），說明茶葉中稀土元素的組成與其種植環境地質密切相關，茶園土壤是茶葉中稀土元素主要來源之一[31]。

2.2 元素相關性分析

圖1 不同產區綠茶中31 種元素之間的相關性熱圖Fig. 1 Heat map showing correlation between 31 elements in green tea samples collected from different producing regions

對茶樣中31 種微量元素進行Pearson相關性分析（圖1），16 種稀土元素中，除Sc外，其余15 種稀土元素相互之間呈現極顯著正相關關系，說明這些元素之間具有較強的協同作用。除稀土元素以外的15 種微量元素中，Pb、As、Cr、Fe和Al與其他元素之間只存在極顯著正相關或顯著正相關；Ba與Mn、Cd和部分稀土元素；Se與Zn和Cd；Ag與Se和Zn；Ni、Cu和Zn之間；Cd與Mn、Mo和Co；Co與Mn、Mo都存在正相關或顯著正相關。表明茶樹在富集上述元素時，元素之間具有一定的協同、相互促進吸收的關系。

另外，15 種稀土元素（除Sc外）與Zn和Ni；S與Se；Co與大部分稀土元素；Ag與Cd、Co和Mo；Ni與Mn和Ba；Cu與Tm、Lu、Tb和Eu；Zn與Cd、Mo、Ba和Mn存在負相關或顯著負相關，揭示這些元素之間呈現相互抑制、拮抗的關系。

2.3 銅仁市綠茶溯源分析

2.3.1 PCA結果

圖2 基于PCA前3 個PC構建的綠茶樣品散點圖Fig. 2 Three-dimensional PCA scatter plot of first three principle components for green tea samples

PCA通過線性變換進行降維處理，以較少的指標反映盡可能多的信息，并對具有代表性的PC數據進行可視化[14,32]。對樣品中具有顯著差異的19 種元素（P＜0.05）進行PCA，選取特征值大于1的成分作為PC，結果表明，前4 個PC（PC1～PC4）的方差貢獻率分別為60.30%、14.49%、10.68%、6.26%，累計方差貢獻率達到91.73%，能夠達到充分反映原始數據信息的目的。PC1主要由Lu、Y、Tb、Ho、Tm和Yb元素構成，PC2主要由Co和Mo元素構成，PC3主要由Co、Ag、Lu、Al和Cd元素構成。以PC1、PC2和PC3的得分作3D圖，從圖2可以看出，各個產區的樣品有聚類的趨勢，但是除了江口縣的樣品可區分，其余3 個產區的樣品均有重疊現象。表明用PCA構建模型未能將這4 個產區的樣品有效區分，但利用特征元素進行茶葉小區域產地溯源是可行的。

2.3.2 S-LDA結果

采用S-LDA對4 個產區綠茶元素含量進行判別分析。選取19 種具有顯著差異性的元素（P＜0.05）作為變量納入模型，結果表明，其中7 種元素（Sc、Ag、Cd、Tm、Yb、Zn、Al）被判別模型保留作為判別指標，同時，根據Wilks’λ值構建了3 個判別函數。這3 個函數解釋了100%變異（判別函數F1、F2和F3分別解釋了所有變異的62.1%、25.7%和12.2%）。典型相關系數分別為0.923、0.838和0.728，類間差異顯著（p1、p2和p3均小于0）[2]，表明判別結果有效。基于所選7 個元素構建判別函數如下：

圖3 基于S-LDA前2 個PC構建的綠茶樣品散點圖Fig. 3 S-LDA scatter plot of first two principal components for green tea samples

利用判別函數F1和F2對4 個產地的樣品分類，如圖3所示，4 個產區的樣品基本可以區分開，江口縣、思南縣和石阡縣相互之間可以完全區分，但沿河縣與思南縣和石阡縣有小部分重疊。進一步將這7 種元素作為判別指標，采用正交驗證法對判別模型進行驗證，結果見表4，對42 個已知樣本的回判正確率為90.5%，交叉驗證成功率為83.3%，可將這7 種元素作為該4 個產地識別的判斷指標。4 個產地的Fisher線性判別式函數如下：

表4 S-LDA對不同產區銅仁綠茶產地溯源的判別結果Table 4 Correct discrimination rates of green tea samples from different producing regions in Tongren city by S-LDA model

2.3.3 OPLS-DA結果

對于樣本量小和自變量較少的數據，采用OPLSDA具有一定優勢。以19 種具有顯著差異的元素（P＜0.05）含量作為特征變量建立統計模型，統計量分別為說明97%的變量可解釋73.7%的組間差異；Q2=0.617，證明該模型具有較好的預測能力（R2和Q2均大于0.5）。變量對變異權重參數（variable importance in projection，VIP）值如圖4所示，VIP值可以量化每個變量對分類的貢獻，VIP值越大（＞1），對地域判別的差異性越顯著[33]，6 種元素（Mo、Lu、Al、Ag、Tm和Co）的VIP值大于1，說明上述6 種元素在4 個產區樣品中具有顯著差異，尤其是Mo、Lu和Al的VIP值分別為1.776、1.586和1.493，表明這3 種元素可作為4 個產區樣品鑒別的特征元素。不同區域綠茶樣本散點圖如圖5所示，4 個產區的樣品中，思南縣和沿河縣的樣品仍有小部分重疊，表明這2 個產區可能具有相似的地質條件、生態氣候和茶園栽培管理方法，后續可進一步探究這2 個產區茶園土壤、茶樹品種等的異同性。該方法的正確判別率為92.86%（表5），其中，石阡縣的茶樣判別率為100%，高于S-LDA法的85.7%（表4），表明該模型的準確度較高。

圖4 19 種具有顯著差異元素的VIP值Fig. 4 Variable importance in the projection (VIP) obtained from the OPLS-DA mode

圖5 前2 個PC的OPLS-DA得分圖Fig. 5 OPLS-DA score plot of first two principle components

表5 OPLS-DA對不同產區銅仁綠茶產地溯源的判別結果Table 5 Correct discrimination rates of green tea samples collected from different producing regions in Tongren city by OPLS-DA model

3 結 論

貴州省銅仁市江口縣、石阡縣、思南縣和沿河縣的42 個綠茶茶樣中Al、Mn、Fe和Zn等元素含量較高；Cd、Pb、As、Cr和Cu等重金屬含量較低，均未超出國家或行業標準限量值；樣品中的稀土元素總量較低，其中，江口縣樣品未檢出Tm、Lu和Tb，石阡縣和思南縣的茶樣中未檢測出Tm和Lu元素。

根據相關性分析表明，此次所測定的31 種微量元素之間存在相互協同或者拮抗的關系，特別是稀土元素之間存在極顯著正相關關系，說明在茶樹生長過程中，這些元素的吸收和利用是相互影響的，其相互作用的原理有待進一步研究。

利用PCA、S-LDA和OPLS-DA對4 個產區的樣品進行判別，結果表明PCA無法有效區分4 個產區樣品；S-LDA判別正確率為90.5%，交叉驗證準確判別率為83.3%；OPLS-DA的判別最佳，正確率為92.86%，由此說明元素含量測定結合多元統計分析可有效實現茶葉小范圍產地區域的正確區分。其中，采用S-LDA方法對江口縣和思南縣的判別準確率可達到100%，OPLS-DA則可將江口縣和石阡縣的樣品100%準確識別。因此，可進一步結合S-LDA與OPLS-DA，篩選貢獻率較大的指標構建新的模型，提高判別準確率，為茶葉小區域溯源及質量安全可追溯性提供一定的理論依據。