卵巢腫瘤結構域蛋白3敲除小鼠黑質區核因子κB相關炎癥因子表達的變化及其機制

高藝峻 賈鳳菊 焦倩 陳曦 杜希恂 姜宏

(青島大學國家生理學重點(培育)學科，山東 青島 266071)

卵巢腫瘤結構域蛋白3(OTUD3)是去泛素化酶(DUBs)家族OTU亞家族中的一個成員，位于人類染色體1p36.13[1-2]。OTUD3不僅被證實參與腫瘤的發生發展[3-5]，還可以通過抑制線粒體抗病毒信號蛋白(MAVS)Lys63位的多聚泛素化，進一步抑制MAVS的聚集，切斷視黃酸誘導基因1(RIG-1)樣受體(RLR)信號通路上的先天抗病毒免疫應答，從而限制了先天抗病毒免疫信號的傳導[6-7]。為了更加全面地了解OTUD3對先天免疫應答中核因子κB(NF-κB)相關炎癥因子的影響，本研究選用24月齡OTUD3敲除(OTUD3-/-)雄性小鼠及其同窩野生型(WT)雄性小鼠各3只，對6只小鼠的中腦黑質組織進行轉錄組學測序(RNA-seq)分析，篩選出差異表達基因(DEGs)，并通過KEGG通路富集分析可能參與先天免疫和神經炎癥相關的信號通路，同時采用實時熒光定量PCR(RT-qPCR)實驗對篩選出的DEGs進行mRNA水平的驗證，旨在探討OTUD3對NF-κB相關炎癥因子表達的影響，以及OTUD3參與調控神經炎癥反應的作用機制。現將結果報告如下。

1 材料和方法

1.1 實驗動物與分組

24月齡OTUD3-/-雄性小鼠3只，同窩WT雄性小鼠3只，體質量(30±2)g，均由中國人民解放軍軍事科學院軍事醫學研究院生命組學研究所、國家蛋白質科學中心(北京)提供。實驗動物分為WT組與OTUD3-/-組，小鼠在室溫(23±1)℃，濕度(50±10)%，12/12 h晝夜循環光照條件下飼養，并自由飲水、進食。所有動物的處理均遵循醫學倫理及原則，倫理編號：201810OTUD3-/-3WT32019-03012。

1.2 儀器與試劑

水合氯醛、三氯甲烷(美國Sigma公司)，TRIzol Reagent(美國Thermo fisher Scientific公司)，逆轉錄試劑盒(AG11711,湖南艾科瑞生物工程有限公司)，qPCR試劑盒(AG11701,湖南艾科瑞生物工程有限公司)，S1000 Thermal Cycler PCR儀(美國BIO-RAD公司)，CFX96TMReal-Time System(美國BIO-RAD公司)。

1.3 小鼠黑質組織的收集及RNA-seq分析

腹腔注射水合氯醛麻醉小鼠后，迅速斷頭取腦，在冰上取出雙側黑質組織，并置于液氮罐中保存。測序樣本使用干冰進行保存并送至深圳華大基因股份有限公司(以下簡稱華大基因)進行RNA-seq相關分析。

1.4 小鼠黑質RNA的提取

將取材后的WT小鼠和OTUD3-/-小鼠的黑質組織置于EP管中，加入TRIzol Reagent 500 μL，使用電動研磨棒研磨組織；勻漿化的樣品室溫溫育5 min，使核蛋白復合物完全解離后，加入三氯甲烷150 μL，劇烈甩動離心管15 s，使其充分混勻，室溫溫育5 min；再于4 ℃下不超過12 000 r/min離心15 min；離心后混合物分為3相，RNA位于上層水相；將水相轉移至新的離心管當中，加入異丙醇250 μL，沉淀RNA；室溫溫育10 min后，4 ℃下不超過12 000 r/min離心10 min；去上清液，加入體積分數0.75的乙醇溶液500 μL；渦旋振蕩器處理樣品，4 ℃下不超過7 000 r/min離心5 min；稍微晾干RNA，加入無酶無菌水10 μL使其全部溶解。

1.5 RT-qPCR實驗驗證小鼠黑質DEGs

將提純的RNA置于65 ℃的水浴條件下變性5 min，立即置于冰上。首先將gDNA Clean Reagent 1 μL，5×gDNA Clean Buffer 2 μL，總RNA 1 μg，后加入無酶無菌水至10 μL配成反應體系，42 ℃下反應 2 min，4 ℃下恒溫維持以去除基因組DNA。再將上述反應液10 μL加入Evo M-MLV RTase Enzyme Mix 1 μL，RT Primer Mix 1 μL，5×RTase Reaction Buffer Mix I 4 μL，加入無酶無菌水至20 μL配成逆轉錄反應體系，37 ℃下反應15 min，85 ℃下反應 5 s，后4 ℃下恒溫維持完成逆轉錄反應。最后按照qPCR試劑盒說明書要求配制qPCR反應體系20 μL：2×SYBR?Green Pro Taq HS Premix 10 μL，上游引物0.4 μL，下游引物0.4 μL，加入無酶無菌水至20 μL。上機反應：95 ℃預變性30 s；然后95 ℃擴增5 s，60 ℃延伸30 s，共進行40個循環；最后65 ℃退火15 s終止擴增反應。引物序列由湖南艾科瑞生物工程有限公司進行設計并合成。GAPDH上游引物序列：5′-GCACCGTCAAGGCTGAGAAC-3′，GAPDH下游引物序列：5′-TGGTGAAGACGCCAGTGGA-3′，LBP上游引物序列：5′-TCTCCAGACTCTGCCAGTCAC-3′，LBP下游引物序列：5′-CAACTGGAGAGCGG-TGATTCC-3′，COX2上游引物序列：5′-CTGGA-ACATGGACTCACTCAGTTTG-3′，COX2下游引物序列：5′-AGGCCTTTGCCACTGCTTGTA-3′。

1.6 數據分析

2 結 果

2.1 數據質量評估

6只小鼠的測序錯誤率均低于1%，Clean reads的堿基含量均小于50，Q30約為91%，OTUD3-/-組與WT組間基因表達量的Pearson相關系數均大于0.86，數據的可靠性高，基因的相似性高，可進行后續分析。

2.2 DEGs表達分析

OTUD3-/-組和WT組間共有274個DEGs，其中75個基因在WT組呈現高表達，199個基因在OTUD3-/-組呈現高表達。

2.3 KEGG通路富集分析

分析結果顯示，有4個DEGs富集到NF-κB通路上，其中脂多糖結合蛋白(LBP)、環氧合酶2(COX2)、C-C基序趨化因子19(CCL19)和細胞黏附因子1(ICAM1)的log2(OTUD3-/-/WT)值分別為2.13、1.42、3.50和1.07，與WT組相比，差異均具有顯著性(P<0.05)。2個基因富集在NF-κB的經典通路上，分別為LBP和COX2，2個基因富集在NF-κB的非經典通路上，為CCL19和ICAM1。

2.4 DEGs mRNA水平的驗證

結果顯示，WT組LBPmRNA水平為0.67±0.05，OTUD3-/-組為2.70±0.22，組間比較差異具有統計學意義(t=7.81,P<0.05)；WT組COX2 mRNA表達水平為1.00±0.02，OTUD3-/-組為1.15±0.04，組間比較差異具有顯著意義(t=3.11,P<0.05)。

3 討 論

OTUD3是DUBs中第二大家族OTU家族成員之一，含有398個氨基酸，主要是由OTU結構域和UBA結構域組成，具有典型的半胱氨酸酶活性中心[1-2,7]。在人類基因組中約有100個活躍的DUBs參與疾病代謝過程，包括神經變性、炎癥、感染和癌癥等[10]。2003年，AMERIK等[11]在果蠅卵巢組織中首次發現了OTUD3。目前，國內外關于OTUD3功能的報道局限于OTUD3作為DUB的作用，如參與結腸癌[12]、乳腺癌[4]、肺癌[5]等癌癥的發生等。此外，ZHANG等[6]發現當機體遭受外源性病毒感染時，OTUD3可以調控機體的先天抗病毒免疫應答反應。OTUD3-/-小鼠黑質NF-κB經典通路上的IKKε被激活，導致IKKε的上游信號銜接蛋白促炎癥細胞因子(TNF)受體的結構發生改變[6,13-15]，進而促使IKKε下游信號蛋白IκBα發生磷酸化和泛素化降解，NF-κB被激活并進入到細胞核內，從而調控下游靶基因的轉錄[16-18]。因此，IκBα的降解可以一定程度促使NF-κB激活。而在非經典通路上NF-κB主要通過調控p100、p52進入細胞核，p100是IκB蛋白的另一種形式，NF-κB可與p52形成二聚體穿過核膜進入細胞核，誘導NF-κB下游炎癥因子的表達[19]。機體的先天免疫系統可以通過非特異性的方式抵御外來感染，NF-κB是調控這種復雜反應的關鍵轉錄因子之一[20]。

本研究RNA-seq結果顯示，與NF-κB相關的4個炎癥因子表達顯著上調，經典通路上游因子LBP表達升高，下游炎癥因子COX2表達升高，非經典通路的下游因子CCL19、ICAM1表達升高。其中，PARK等[21]發現LBP與脂多糖(LPS)具有高度親和性，參與LPS誘導的炎癥反應。XUE等[22]發現COX2可通過前列腺素和細胞因子的協同作用被誘導激活，通常在慢性炎癥組織中高表達[23]。根據本研究結果，OTUD3-/-小鼠黑質LBP表達上調，這可能會加速細胞中IκBα蛋白的降解，促使NF-κB與其解離并進入細胞核，導致下游相關炎癥因子COX2表達也上調，使得經典通路上NF-κB與p65/p50二聚體解離而進入細胞核內，導致下游的炎癥因子表達升高。因此，LBP的表達上調可能是由于OTUD3-/-后，造成小鼠黑質NF-κB下游炎癥因子表達上調的原因之一。

NF-κB非經典通路下游的炎癥因子ICAM1在炎癥過程中介導白細胞與血管內皮細胞的黏附，是神經細胞中參與信號轉導、突觸可塑性、學習記憶等過程的重要因子[24-25]。CCL19廣泛參與慢性炎癥反應的發生發展，且持續的炎癥反應會導致其表達上調[26-29]。根據本實驗結果，OTUD3-/-小鼠黑質ICAM1、CCL19的表達上調，表明NF-κB非經典通路被激活，參與了神經炎癥反應的發生[30]。因此，OTUD3-/-小鼠黑質缺失OTUD3，會導致NF-κB下游炎癥因子COX2、ICAM1以及CCL19的表達上調。

盡管本研究觀察到OTUD3參與調控NF-κB相關炎癥因子的表達，并明確了OTUD3-/-小鼠黑質中LBP和COX2 mRNA表達水平上調，但其具體機制以及在神經免疫炎癥反應中的作用還需進一步探討。