常規體外受精與卵泡漿內單精子注射中異常受精胚胎形成的影響因素分析

王金鸞 張寧 李婷婷

(山東中醫藥大學中醫學院，山東 濟南 250014)

在常規體外受精(IVF)和卵胞漿內單精子注射(ICSI)過程中，正常胚胎的形成受到精卵質量、實驗室的培養環境等多種因素影響，胚胎形成過程中任何環節出現錯誤都可能會造成異常受精胚胎的出現。異常受精是指受精過程中未觀察到雌雄兩個原核(2PN)，受精卵出現原核數目的異常，包括未見原核(0PN)、單原核(1PN)、多原核(≥3PN)[1]。在實驗室胚胎觀察過程中，精卵結合后出現異常受精的胚胎通常不作為移植的首選胚胎，甚則直接遺棄此類胚胎，不僅造成胚胎的浪費，同時高異常受精率給高齡、卵巢功能減退等患者也帶來巨大的經濟、生理以及心理負擔[2]。本研究通過Logistic回歸分析分析常規IVF/ICSI中可能導致異常受精胚胎形成的影響因素，以期提高臨床上卵母細胞的利用率，減少胚胎浪費。

1 材料與方法

1.1 材料來源

回顧性分析2019年1月—2020年5月就診于山東中醫藥大學附屬醫院中西醫結合生殖與遺傳中心的IVF/ICSI助孕的1 018個周期患者的臨床資料。按照是否有異常受精將患者分為異常受精組(n=871)和對照組(n=147)，其中異常受精組至少出現1個非雙原核(2PN)的受精卵。納入標準：女方年齡≥20歲；夫婦染色體正常；女方免疫學檢查正常。排除標準：短時受精的患者；嚴重遺傳性疾病患者；供精、供卵患者；獲卵數為0的患者。

1.2 控制性超促排卵(COH)方案

根據患者的具體情況選擇常規的黃體期長方案或者拮抗劑方案。黃體期長方案：在前次月經的黃體中期注射半支長效促性腺激素釋放激素激動劑(GnRH-α，達菲林，規格3.75 mg/支，法國博福-益普生制藥有限公司)降調節，垂體達到降調標準[雌二醇(E2)的水平<50 ng/L，黃體生成激素(LH)的水平<5 U/L，子宮內膜厚度<4～5 mm，無功能性囊腫]后使用促性腺激素(Gn)，注射重組卵泡刺激素(FSH，果納芬，規格450 U，瑞士默克雪蘭諾有限公司；或普麗康，規格600 U，美國默沙東公司)或人絕經期促性腺激素(HMG，規格75 U，珠海麗珠集團麗珠制藥廠)促排卵，根據陰道超聲下卵泡數目、大小和血清性激素水平確定Gn的起使劑量。當患者2～3個主導卵泡直徑達18～20 mm時，肌內注射10 000 U人絨毛膜促性腺激素(hCG，珠海麗珠集團麗珠制藥廠)進行扳機，36 h左右行陰道超聲引導下穿刺取卵術。拮抗劑方案：月經第2～3天根據患者情況使用Gn 75～300 U啟動，陰道超聲監測卵泡發育情況，從主導卵泡直徑達12～14 mm時開始每天加用GnRH拮抗劑0.25 mg(思則凱，規格0.25 mg/支，瑞士默克雪蘭諾有限公司)直至hCG日，扳機后取卵。

1.3 授精及胚胎評價

實驗室胚胎受精方式(IVF/ICSI)結合患者自身情況加以選擇。IVF適應證：①女方因各種因素導致的配子運輸障礙；②排卵障礙；③子宮內膜異位癥；④男方少、弱精子癥；⑤不明原因不孕；⑥免疫性不孕。ICSI適應證：①嚴重的少、弱、畸精子癥；②不可逆的梗阻性無精子癥；③生精功能障礙；④免疫性不育；⑤體外受精失敗；⑥精子頂體異常。取卵當日男方手淫法取精后，采用上游法優化處理精子。取卵4～6 h后按照常規IVF/ICSI的操作方式進行授精，16～18 h后觀察原核及極體的出現情況，依此判斷受精情況。

1.4 觀察指標

①女方年齡：按照年齡分為20～30、31～35、≥36歲；②基礎FSH(bFSH)：按照bFSH的水平分為<10 U/L、≥10 U/L；③基礎E2(bE2)：按照bE2水平分為<25、25～45、>45 ng/L；④體質量指數(BMI)：按照中國人BMI分級標準分為<24、≥24 kg/m2；⑤用藥治療方案：包括黃體期長方案、拮抗劑方案；⑥男方前向精子運動率(PR)：按照男方PR分為<32%、≥32%；⑦人絨毛膜促性腺激素(hCG)日E2：按照hCG日E2的水平分為<2 000、2 000～3 000、>3 000 ng/L；⑧實驗室受精方式：包括常規IVF、ICSI。將上述資料進行比較分析，研究其與異常受精胚胎形成的相關性。

1.5 統計學方法

使用SPSS 25.0統計軟件分析數據。計數資料以例(χ/%)表示，單因素分析采用χ2檢驗，異常受精胚胎形成的影響因素采用二分類多因素Logistic回歸分析進行分析。所有分析均為雙側檢驗，檢驗水準α=0.05，以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 異常受精胚胎形成影響因素的單因素分析

單因素分析結果表明，兩組女方年齡、bFSH、bE2、用藥方案、精液PR率、hCG日E2水平、實驗室受精方式比較，差異具有統計學意義(χ2=6.674～74.908，P<0.05)；兩組的BMI比較，差異無統計學意義(P>0.05)。見表1。

表1 異常受精胚胎形成影響因素的單因素分析[例(χ/%)]

2.2 異常受精胚胎形成影響因素的多因素Logistic回歸分析

將是否存在異常受精胚胎作為因變量(無=0，有=1)，將上述單因素分析有統計意義的因素作為自變量，納入Logistic回歸模型進行多因素分析。變量賦值如下：①女方年齡：20～30歲=0，31～35歲=1，≥36歲=2；②bFSH水平：<10 U/L=0，≥10 U/L=1；③bE2水平：<25 ng/L=0，25～45 ng/L=1，>45 ng/L=2；④用藥方案：拮抗劑方案=0，黃體期長方案=1；⑤精液PR率：<32%=0，≥32%=1；⑥hCG日E2水平：<2 000 ng/L=0，2 000～3 000 ng/L=1，>3 000 ng/L=2；⑦實驗室受精方式：常規IVF=0，ICSI=1。結果顯示，女方年齡≥31歲、hCG日E2水平>3 000 ng/L是異常受精胚胎形成的危險因素；黃體期長方案、ICSI的受精方式是異常受精胚胎形成的保護因素(P<0.05)。見表2。

表2 異常受精胚胎形成影響因素的多因素Logistic回歸分析

3 討 論

隨著臨床醫療水平的提高和輔助生殖技術的發展進步，IVF、ICSI的成功率逐年上升，但輔助生殖技術中胚胎的多精受精率仍達2%～10%[3-5]。在臨床實踐中，0PN、1PN、≥3PN胚胎臨床利用率低，與2PN胚胎相比，其發育異常可能性更高[6]。一部分生殖中心對于無可利用2PN胚胎的患者，會選擇0PN胚胎進行移植。有文獻報道稱，0PN胚胎的囊胚形成率為16.7%，其中包含44.4%的正常染色體胚胎[7]，說明0PN來源的胚胎移植理論上具有一定的可實施性。趙雙丹等[8]研究發現，0PN+2PN移植組的種植率與臨床妊娠率均顯著低于2PN移植組，考慮0PN來源的胚胎存在一定的遺傳缺陷，應謹慎用于臨床移植。1PN胚胎的形成機制主要與孤雌激活[9]和兩個原核過早融合相關[10-11]。相關研究發現，IVF中1PN來源胚胎的囊胚養成率顯著低于2PN來源胚胎(14.8%與36.4%)，ICSI則分別為6.6%和34.0%[12]。≥3PN胚胎的形成與染色體異常密切相關，包括復雜嵌合體、三倍體等[13]。臨床研究發現，與正常受精胚胎相比，異常受精胚胎細胞碎片率高、發育速度慢、潛能差[6,13]。在臨床診療中，醫生應首選2PN胚胎進行移植，若無2PN來源胚胎時，0PN/1PN胚胎可作為備選胚胎，經患者充分知情同意后選擇性進行移植。

異常受精的發生與卵子成熟障礙、精卵結合異常等諸多因素相關。本研究單因素分析結果顯示，女方年齡、bFSH、bE2水平、用藥方案、精液PR率、hCG日E2水平、實驗室受精方式均與異常受精胚胎的出現具有顯著相關性，而進一步采用多因素Logistic回歸分析表明，女方年齡≥31歲、hCG日E2水平>3 000 ng/L是異常受精胚胎形成的危險因素；黃體期長方案、ICSI的受精方式是異常受精胚胎形成的保護因素。

女性年齡對卵母細胞質量有重要影響，年齡越大，卵巢儲備功能及卵子質量越差，優質卵子率及優質胚胎率越低，可利用胚胎數減少，妊娠率及活產率均受影響[14-15]。有研究表明，高齡女性因卵母細胞質量下降，線粒體的數量減少及功能減退，腺嘌呤核苷三磷酸(ATP)合成減少，供能不足，影響細胞減數分裂，造成胚胎異常受精率升高[16]。本研究發現，女性年齡≥31歲是異常受精的相關危險因素，高齡造成女性卵子不可逆老化，而卵子老化對卵母細胞胚泡產生率及囊胚形成率均有影響，無法支持正常受精的發生[17]。

卵母細胞在受精過程中釋放的皮質顆粒可預防多精受精的發生，不成熟的卵母細胞其皮質顆粒功能不足，易增加多精受精的發生概率[18]。本研究結果顯示，異常受精組的hCG日E2水平明顯高于正常受精組，hCG日E2水平>3 000 ng/L是異常受精胚胎形成的危險因素。hCG日E2水平升高可增加獲卵數，提高卵子成熟率。但有報道稱HCG日的高E2水平會影響卵母細胞質量，可能與補充外源性Gn后出現卵巢高反應相關[19]。ANDERSEN等[20]研究發現，輔助生殖技術中外源性Gn的使用易造成卵母細胞發育代謝異常、胞核與胞質發育不同步等問題，而卵巢高反應在一定程度上加重了卵母細胞的異常，增加了受精異常的發生風險。SANTOS等[21]研究表明，超促排卵可增加卵母細胞的非整倍體率，影響卵母細胞質量。而HCG日高E2水平會造成胚胎發育速度的減緩，降低優質胚胎率[22]。

常規IVF/ICSI受精方式的選擇具有其相對應的適應證，不同的受精方式對胚胎的形成發育有一定的相關性。本研究發現，ICSI的受精方式是異常受精胚胎形成的保護因素。有研究表明，與ICSI相比，IVF的多原核受精率明顯增高[23]。ICSI授精時會對卵母細胞進行挑選，排除未成熟或過熟的卵子，而IVF為精卵自由結合，卵母細胞發育的同步性受不同促排卵方案的影響，因此精子與不成熟卵子或過熟卵子的結合概率較ICSI增加，故多原核受精率升高。張亞楠等[24]研究發現，與IVF相比，ICSI的0PN及1PN胚胎發生率更低，體外受精方式是形成0PN及1PN胚胎的重要影響因素，與本研究結果相一致。

本研究結果表明，黃體期長方案是異常受精胚胎形成的保護因素。黃體期長方案應用GnRH激動劑抑制垂體的反應性，使得自身分泌的FSH、LH減少，卵泡的發育主要依賴于外源性Gn，卵泡發育同步性較好，成熟度也較為一致。近年來拮抗劑方案憑借其治療時間短、費用少的優勢，臨床應用較為廣泛[25]。拮抗劑方案應用GnRH拮抗劑競爭性結合垂體的GnRH受體，對自身分泌的FSH、LH抑制較輕，卵母細胞發育受內源性Gn與外源性Gn的共同影響，其發育的同步性明顯變差，可能影響卵母細胞的成熟度，導致未成熟卵子、過熟卵子與精子結合，造成異常受精胚胎的出現。朱潔茹等[26]研究發現，拮抗劑方案的獲卵數、成熟卵子數均顯著低于黃體期長方案。LIN等[27]根據hCG日優勢卵泡的不同比例將患者分為高、中、低優勢卵泡組，GnRH-α長方案中低優勢卵泡組(優勢卵泡比例<20%)的正常受精率最高，拮抗劑方案中低優勢卵泡組的臨床妊娠率與高優勢卵泡組相比明顯降低。同時大數據研究表明，卵巢低反應人群中，拮抗劑方案的使用率為53%，而黃體期長方案的使用率僅為9%，拮抗劑方案的納入人群存在一定的偏向性，可能影響異常受精的發生[28]。

綜上所述，女方年齡、hCG日E2水平、用藥方案、實驗室受精方式均是常規IVF/ICSI中異常受精胚胎形成的影響因素。本研究為單個生殖中心數據的回顧性分析，缺乏多地區、多中心、大樣本量的前瞻性研究數據分析，研究結果可能存在一定的偏倚。但對臨床工作的開展仍有一定的提示意義，臨床工作者應了解形成異常受精胚胎的影響因素及其危害性，結合患者情況綜合判斷，采取相應的預防及治療措施，提高卵母細胞利用率，為減少胚胎浪費、降低異常受精胚胎發生率提供指導。