HBV相關原發(fā)性肝癌患者循環(huán)血miR-155水平與相關免疫細胞因子、HBV-DNA載量的關系及意義

杜敬佩 王園園 李長安 趙巍峰

(新鄉(xiāng)醫(yī)學院第三附屬醫(yī)院感染性疾病科，河南 新鄉(xiāng) 453000)

近些年來，逐漸發(fā)現(xiàn)了較多的與原發(fā)性肝癌(PHC)發(fā)病相關的微小RNA(miRNA)，并成為臨床診斷和治療中最具潛力的生物分子標志物[1]。而且由于缺乏免疫原性，某些miRNAs也逐漸成為抗病毒治療的理想靶點[2]。眾多循證醫(yī)學研究業(yè)已證實，乙型肝炎病毒(HBV)感染引起的急慢性肝疾病是PHC發(fā)病的獨立危險因素[3-5]；而且我國也屬于HBV高感染地區(qū)，90%以上的PHC患者都具有HBV感染背景[6]。因此，本研究從靶基因水平尋找與HBV相關miRNA，并進一步分析其與HBV相關PHC發(fā)生、HBV病毒載量、相關免疫細胞因子的關系，旨在為PHC的早期診斷及靶向治療提供一定的理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料來源

收集2019年1月—2020年3月于我院肝病科乙肝表面抗原(HBsAg)或HBV-DNA檢測陽性患者的血液樣本共180例。包括HBV相關PHC患者(PHC組)75例，乙型肝炎肝硬化患者(HBV-LC組)45例，慢性乙型肝炎患者(CHB組)30例，無癥狀慢性HBV攜帶者(HBV組)30例。所有患者采集血液樣本前均未行外科手術或其他抗癌治療，其中HBV組患者經相關血清學檢查確診，HBV-LC組經肝穿刺活檢或影像學檢查確診，PHC患者經組織病理學檢查確診；排除標準：①其他肝炎病毒感染、酒精、自身免疫、代謝因素等引起的肝臟疾病；②合并心、腎等功能嚴重障礙者或其他惡性腫瘤、血液系統(tǒng)疾病者。根據PHC患者肝功能狀態(tài)、腫瘤特點、治療方式等進行BCLC分期。另外收集同時期健康人群血液樣本50例作為對照組，各項生化指標均在正常參考范圍內且體格檢查、影像學檢查等均無異常。各組受檢者年齡、性別、體質量指數(shù)(BMI)、吸煙史者比例，差異無顯著意義(P>0.05)。本研究所有受檢者均簽署了知情同意書，并符合《赫爾辛基宣言》。

1.2 實驗方法

1.2.1肝功能檢測 采用UniCelDxI800免疫分析儀(美國Backman-Coulter公司)檢測所有受檢者血清中谷丙轉氨酶(ALT)、谷草轉氨酶(AST)、總膽紅素(T-BIL)以及血清白蛋白(ALB)的水平。根據臨床生化指標，包括肝性腦病(期)、腹水、血清T-BIL水平、ALB水平、凝血酶原時間進行肝功能Child-Pugh分級，分為A級：5～6分，B級：7～9分，C級：>9分。

1.2.2血漿總RNA提取和實時熒光定量聚合酶鏈式反應(RT-qPCR)方法檢測受檢者血漿中miR-155的水平 從-80 ℃樣本庫中取出血漿樣本，采用miR-cute miRNA提取試劑盒提取總RNA，加入30 μL DEPC處理過的ddH2O溶解RNA并分裝保存。取2 μL用超微量紫外分光光度計檢測RNA濃度和純度。取1 μg RNA采用TransScript miRNA First-Strand cDNA Synthesis試劑盒進行莖環(huán)法逆轉錄反應，miR-155引物：5′-GTCGTATCCA-GTGCAGGGTCCGAGGTATCGCACTGGATAC-GACCAGACTCC-3′。取2 μL cDNA作為模板，加入正、反向引物序列各0.5 μL后，利用SYBR?Premix Ex TaqTM試劑盒進行PCR擴增：95 ℃預變性1 min，1個循環(huán)；94 ℃變性10 s，58.5 ℃延伸40 s，72 ℃退火40 s，共37個循環(huán)。使用StepOne Software軟件分析數(shù)據，以2-△△CT表示目的基因的表達量。miR-155引物：上游引物5′-GCAGTCA-TCCTTCATTCCACC-3′，下游引物5′-GTGCAG-GGTCCGAGGTAT-3′；小分子內參U6，上游引物5′-CATTGGGAGTTTCAAATCAGC-3′，下游引物5′-CTTTGCATTCTTGGACGAGG-3′。每個樣品重復實驗3次。

1.2.3血清中免疫細胞因子的檢測 采用(雙抗體夾心法)酶聯(lián)免疫吸附測定試劑盒檢測各組受檢者血清中Th1類細胞因子[白細胞介素-12(IL-12)、干擾素-γ(IFN-γ)、腫瘤壞死因子α(TNF-α)]和Th2類細胞因子(IL-4、IL-6、IL-10)的水平。試劑盒購自上海西唐生物科技有限公司。

1.2.4血清中HBV病毒載量的檢測 采用PCR熒光探針法檢測各組受檢者血清中HBV病毒載量。首先采用一步法在血清中加入核酸釋放劑，然后采用HBV核酸擴增熒光檢測試劑盒檢測各受檢者血清中HBV-DNA含量，擴增條件：50 ℃ 2 min，94 ℃ 5 min，94 ℃ 15 s，57 ℃ 30 s，45個循環(huán)。乙型肝炎病毒熒光定量PCR檢測試劑盒購自于廣州Targene公司。

1.2.5血清甲胎蛋白檢測 采用化學發(fā)光微粒子免疫檢測法檢測PHC患者血清甲胎蛋白水平。試劑盒購自上海雅培公司。

1.3 統(tǒng)計學分析

2 結 果

2.1 各組受檢者血漿中miR-155和血清中相關免疫細胞分子水平的比較

各組受檢者血漿中miR-155和血清中IL-12、TFN-γ、IL-4、IL-6、IL-10水平比較，差異有統(tǒng)計學意義(F=8.252～661.419，P<0.05)，但是各組血清TNF-α水平比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；與對照組相比，PHC組患者血漿中miR-155水平明顯升高，同時血清中IL-12、IFN-γ、IL-4、IL-6、IL-10水平均明顯降低(P<0.05)；與HBV組、CHB組和HBV-LC組患者相比，PHC組患者血漿中miR-155水平明顯升高，血清中IL-12、IFN-γ、IL-6水平明顯降低(P<0.05)；HBV相關肝疾病的4組患者血清中TNF-α、IL-4和IL-10水平比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表1。

表1 各組受檢者血漿中miR-155和血清中相關免疫細胞分子水平比較

2.2 PHC組患者血漿中miR-155與血清中相關免疫細胞分子水平的相關性

HBV相關PHC患者血漿中miR-155的水平與血清中IL-12、IFN-γ水平呈負相關(r=-0.595、-0.478，P<0.01)，同時與血清中IL-4、IL-6、IL-10水平則均呈正相關(r=0.285～0.548，P<0.01、0.05)。

2.3 PHC組患者血漿中miR-155與HBV-DNA載量的相關性

Pearson相關性分析顯示，PHC組患者血漿中miR-155水平與HBV-DNA載量呈正相關性(r=0.714，P<0.01)。

2.4 PHC組患者血漿中miR-155水平與血清中甲胎蛋白水平的相關性

Pearson相關性分析顯示，PHC組患者血漿中miR-155水平與血清中甲胎蛋白水平呈正相關性(r=0.656，P<0.01)。

2.5 血漿中miR-155水平和PHC組患者臨床特征的關系

血漿中miR-155水平與PHC患者性別、年齡、腫瘤是否微血管侵犯無關(P>0.05)，然而肝功能Child-Pugh分級C級患者血漿中miR-155水平高于A～B級患者(t=3.218，P<0.01)，腫瘤BCLC分期C～D期患者血漿中miR-155水平高于A～B期患者(t=3.455，P<0.05)，同時腫瘤直徑>5 cm患者血漿中miR-155水平顯著高于直徑≤5 cm患者(t=5.187,P<0.01)。見表2。

表2 血漿中miR-155水平和PHC組患者其他病理特征的關系

2.6 血漿中miR-155對HBV相關性PHC的診斷價值

ROC曲線分析顯示，血漿中miR-155對HBV相關性PHC診斷的靈敏度為94.5%，特異度為68.5%，AUC為0.892(95%CI=0.810～0.942)。見圖1。

圖1 血漿中miR-155診斷HBV相關性PHC的ROC曲線圖

3 討 論

眾多研究證實，HBV活躍復制是肝炎肝硬化和PHC發(fā)生的獨立危險因素[7-8]，但是其潛在的HBV導向致癌的分子機制尚存在巨大的爭議。隨著分子生物學和生物信息學技術發(fā)展，miRNAs組學分析對于推動PHC臨床精準醫(yī)療提供新的研究思路。

慢性HBV感染的自然過程可分為三個階段：免疫耐受期、免疫清除期和殘留期或非活動期，然而其中確切的相關機制仍不清楚。miRNAs是一類小的非編碼RNA，大約有22個核苷酸長度，參與先天性以及后天性免疫應答。幾乎所有的DNA病毒包括HBV，都具有自己獨特的miRNA體系[9]。但由于通過計算機模擬手段，并未獲得與3′端人類基因組相匹配的HBV編碼miRNA[10]，因此HBV編碼的miRNA是否具有致癌功能尚存有爭議，而眾多研究卻證實，HBV產物可影響宿主細胞miRNAs表達譜，包括某些具有促癌或抑癌活性的miRNAs，進而參與宿主細胞的惡性癌變過程[11-13]。HBV尤其是乙肝病毒X蛋白(HBx)通過上調宿主細胞miR-155表達，進而抑制抑癌基因ZHX2，從而促進肝癌細胞的增殖，HBx是肝癌中主要的HBV蛋白之一，可激活癌基因，導致表觀遺傳修飾，調控非編碼RNA的表達，進而影響腫瘤細胞的增殖、凋亡、代謝、轉移等[14]。因此基于細胞實驗的結果，推斷miR-155水平明顯升高可能是HBV相關肝細胞癌進展的重要因素，而且本研究也證實，PHC患者肝功能越差、腫瘤分化程度越高、腫瘤直徑越大，血漿中miR-155表達水平越高。miR-155是PHC發(fā)生過程中重要的致癌基因，如FU等[15]證實，miR-155通過靶向PTEN基因激活PI3K/AKT通路促進肝細胞癌細胞體內和體外增殖。本研究結果亦顯示，HBV相關性肝疾病患者血漿中miR-155表達水平均顯著高于對照組，提示miR-155在HBV相關性肝疾病中屬于功能性基因，這與上述基礎研究結論基本一致；而且在PHC患者中，隨著HBV-DNA載量增加，血漿中miR-155表達量也相應上升，說明兩者存在一定的調控關系，miR-155表達量在一定程度上可反應HBV病毒復制程度。

此外，HBV持續(xù)感染狀態(tài)導致PHC的發(fā)生過程是一個多因素參與，涉及多種機制的復雜過程[16]，與宿主的免疫功能也密切相關，包括CD4+T細胞亞群功能紊亂[17]、細胞因子的分泌[18]以及某些特異信號通路的轉變[19]等。如CD4+T細胞亞群可進一步分化為Th1和Th2，分別介導細胞免疫應答和體液免疫應答[20-22]。本研究顯示，在HBV相關性肝疾病患者體內Th1/Th2平衡逐漸發(fā)生偏移，雖然Th1類細胞因子(IL-12、INF-γ)和Th2類細胞因子(IL-4、IL-6、IL-10)表達量較對照組均顯著降低，但是Th1類細胞因子(IL-12、INF-γ)表達水平降低更明顯，說明HBV相關性肝疾病患者體內細胞免疫和體液免疫功能均受到不同程度抑制，尤其是PHC患者，Th1型細胞因子表達水平明顯降低，而Th2型細胞因子則占據相對優(yōu)勢。而且PHC患者體內miR-155水平與Th1類細胞因子(IL-12、INF-γ)表達量呈負相關性，但是與Th2類細胞因子(IL-4、IL-6、IL-10)表達量則呈正相關性，說明miR-155可誘導Th1/Th2平衡向Th2型偏移，Th1細胞減少，細胞因子IFN-γ則分泌減少，對Th0分化為Th2細胞的抑制作用減弱，Th2細胞增加，細胞免疫功能下降，從而形成宿主對HBV抗原的免疫耐受，導致HBV持續(xù)感染，并向HBV-LC和PHC方向演變。

我國是HBV感染以及肝癌的高發(fā)病國家之一[23]，根據中國疾病防治中心預估的流行病學數(shù)據顯示，我國的HBsAg攜帶率約為5%～6%，而約85%的PHC患者攜帶HBV感染標志物[24]。雖然我國乙肝疫苗接種已基本實現(xiàn)全國范圍普及，但是仍有部分兒童(16.89%～35.07%)在完成初次三針全接種后出現(xiàn)無應答或低應答情況[25]，因此加強HBV預防和PHC早期篩查工作一直是公共衛(wèi)生領域面臨的巨大挑戰(zhàn)[26]。甲胎蛋白是早期篩查和診斷PHC最常使用的血清腫瘤學指標[27]，其檢測特異度高，但是仍有30%～40%的肝癌患者呈陰性[28-30]，因此尋找新的血清腫瘤學分子勢在必行。本研究結果顯示，血漿中miR-155對于HBV相關性PHC的診斷靈敏度和特異度較高，說明miR-155在PHC的診斷和精準治療方面具有一定的優(yōu)勢，但是是否能夠實現(xiàn)臨床轉化尚需進一步驗證。

綜上所述，miR-155在HBV相關性PHC患者血漿中表達量升高，并且與HBV-DNA載量、Th1/Th2免疫失衡密切相關，可為該類患者臨床早期診斷和篩查提供一定的參考作用。