GPX4對erastin誘導的H9C2細胞脂質過氧化和鐵死亡的影響及其機制

鄭憲鑫 張京 肖丹丹 王建勛

(青島大學基礎醫學院，山東 青島 266071)

鐵死亡(ferroptosis)是一種依賴鐵的程序性細胞死亡形式，其特征是谷胱甘肽過氧化酶4(GPX4)活性喪失和細胞內活性氧水平升高[1]。多種疾病與鐵死亡有關，如神經系統疾病、腫瘤以及缺血再灌注引起的心血管系統疾病等[2-5]。因此，針對調控心肌細胞鐵死亡的研究，對探討心血管疾病新的治療方法具有重要意義。

GPX4是鐵死亡調控通路中關鍵調節因子，保護細胞免于脂質ROS傷害[6-7]。細胞內GPX4活性下降或GPX4直接降解會引發鐵依賴性活性氧增加，進而誘發鐵死亡[8-9]。GPX4介導的鐵死亡在機體發育過程中具有多種作用。研究發現，GPX4基因敲除小鼠體內脂質ROS過量積累，可導致細胞鐵死亡[10-11]；在體外大鼠心肌梗死模型中，心肌細胞中GPX4表達量降低[12]，說明GPX4也與心血管系統疾病密切相關。但GPX4在心肌細胞鐵死亡發生過程中的具體作用還不明確。研究發現，核因子紅細胞2相關因子2(NRF2)與腫瘤細胞鐵死亡的負調節有關，通過敲除腫瘤細胞中的NRF2，能促進腫瘤細胞鐵死亡[2,13]，而且NRF2對GPX4具有轉錄調控作用[14]。但NRF2與GPX4在心肌細胞脂質過氧化和鐵死亡中的作用還有待進一步研究。本研究通過鐵死亡誘導劑erastin誘導心肌細胞鐵死亡，探究GPX4和NRF2對erastin誘導的心肌細胞脂質過氧化和鐵死亡的影響。

1 材料與方法

1.1 材料來源

BODIPYTM581/591 C11及Lipofectamine3000(美國Invitrogen公司)，RNA反轉試劑盒(日本TaKaRa公司)，GPX4單克隆抗體(美國Abcam公司)，NRF2單克隆抗體(中國ABclonal公司)，GPX4、NRF2以及GAPDH的引物(上海吉瑪制藥技術有限公司)，erastin、Ferrostatin-1(Fer-1)、Z-VAD-FMK(Z-VAD)、Deferoxamine(DFO)以及Necrostatin-1(Nec-1)(美國Abmole公司)，丙二醛(MDA)含量檢測試劑盒(北京索萊寶生物技術有限公司)，GPX4過表達質粒(中國華大基因)，NRF2過表達質粒以及GPX4-RNAi(上海吉瑪制藥技術有限公司)。

1.2 實驗方法

1.2.1細胞培養 將H9C2細胞接種于含體積分數0.10胎牛血清的高糖DMEM培養基中，并置于37 ℃、含體積分數0.05 CO2的細胞培養箱內，培養至合適密度后用于后續實驗。

1.2.2細胞分組 將每孔約5.0×105個H9C2細胞鋪于6孔板內,待H9C2細胞融合度為40%左右時進行后續實驗。將H9C2細胞分為6組，A組為對照組，B～F組分別為經erastin(5 μmol/L)、erastin(5 μmol/L)+Fer-1(5 μmol/L)、erastin(5 μmol/L)+DFO(100 μmol/L)、erastin(5 μmol/L)+Z-VAD(10 μmol/L)、erastin(5 μmol/L)+Nec-1(50 μmol/L)處理組。同時，再將H9C2細胞分為5組，G～K組分別為經過erastin(5 μmol/L)+pc DNA3.1、erastin(5 μmol/L)+GPX4、erastin(5 μmol/L)+siGPX4-scr、erastin(5 μmol/L)+si-GPX4、erastin(5 μmol/L)+NRF2處理組。

1.2.3實時熒光定量PCR(RT-qPCR)方法檢測H9C2細胞中GPX4、NRF2 mRNA相對表達水平將每孔約5.0×105個H9C2細胞鋪于6孔板內，按照1.2.2中A～C組的方法處理細胞24 h后，采用Trizol法提取常規培養細胞的總RNA，經逆轉錄合成cDNA，以此為模板進行RT-qPCR。根據試劑盒說明書配制反應體系，以GAPDH作為內參照，每個樣品設3個復孔，實驗重復3次。反應的條件為95 ℃預變性5 min；95 ℃變性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸15 s，共40個循環。采用2-△△CT計算樣本中GPX4以及NRF2 mRNA的相對表達水平。GPX4引物：正向5′-GAGGCAGGAGCCAGGAA-GT-3′，反向5′-ACAGTGGGTGGGCATCGTC-3′。NRF2引物：正向5′-CACATCCAGTCAGAAACCAGTGG-3′，反向5′-GGAATGTCTGCGCCAAA-AGCTG-3′。GAPDH引物：正向5′-CAATGACCCCTTCATTGACC-3′，反向5′-GACAAGCTTCCCGTTCTCAG-3′。

1.2.4PI染色檢測細胞死亡率 待H9C2細胞融合度為40%左右時，按照1.2.2中A～K組的方法處理細胞24 h后，棄掉培養基，用PBS洗滌3次，使用多聚甲醛對細胞固定超過30 min，固定完成后，吸出多聚甲醛，再使用PBS洗滌3次以后，按照Hoechst33342/PI雙染試劑盒說明書操作，最后于熒光顯微鏡下檢測細胞死亡情況。細胞死亡的百分比計算方法為細胞PI陽性數量除以Hoechst33342染色的細胞核總數。

1.2.5Western blot方法檢測細胞中GPX4、NRF2蛋白相對表達量 待H9C2細胞融合度為40%左右時，按照1.2.2中A～C組的方法處理細胞24 h后，收集心肌細胞，提取細胞總蛋白。按照SDS-PAGE凝膠制備說明書配置150 g/L的分離膠以及50 g/L的濃縮膠，電泳、轉膜，然后以50 g/L脫脂奶粉封閉2 h，一抗(1∶500)室溫孵育2.5 h，同時以β-actin作為內參照。TBST洗膜3次后，二抗室溫孵育1 h，重復上述洗膜步驟，顯影，使用Image J軟件分析蛋白條帶灰度值，目的蛋白相對表達量以目的蛋白灰度值/內參照蛋白灰度值計算，結果取3次重復實驗的均值。

1.2.6熒光分光光度法檢測細胞中MDA的含量將H9C2細胞接種于6孔板中，每孔約5×105個細胞，待細胞融合度為40%左右時，將細胞按照要求分為A～K組。處理24 h后，棄掉培養基，用PBS洗滌3次，根據MDA檢測試劑盒說明書操作，收集細胞到離心管內，離心后棄上清液；按照每500萬個細胞加入 1 mL提取液，超聲波破碎細胞，最后使用熒光分光光度法測量細胞中MDA的含量。

1.2.7流式細胞術檢測細胞脂質ROS的含量 將H9C2細胞接種于6孔板中，每孔約5×105個細胞，待細胞融合度為40%左右時，將細胞按照實驗要求分為A～K組。處理24 h后，棄掉培養基，用PBS洗滌3次，根據BODIPYTM581/591 C11檢測試劑盒說明書操作，收集細胞到離心管內，離心后棄上清液，PBS重懸，濾網過濾后使用流式細胞術檢測脂質ROS的含量。

1.3 統計學分析

2 結 果

2.1 Erastin及其抑制劑對H9C2細胞的死亡率及脂質過氧化的影響

經erastin及其抑制劑處理后進行PI染色，結果顯示，C、D組細胞死亡數量很少，而E、F組可見大量細胞死亡(圖1)；A～F組細胞死亡率以及脂質ROS、MDA含量比較，差異具有顯著統計意義(F=22.380～259.500，P<0.05)，其中C、D組與B組比較，上述3個指標均明顯降低(t=4.056～45.500,P<0.05)。見表1。

2.2 過表達GPX4對erastin誘導的H9C2細胞脂質過氧化和鐵死亡的影響

經erastin及轉染過表達GPX4質粒處理后，A、B、G、H組細胞死亡率及脂質ROS、MDA含量比較差異均有顯著意義(F=4.069～488.900，P<0.05)，其中H組與G組比較，上述3個指標均明顯降低(t=2.044～16.750,P<0.05)。見表1。

2.3 抑制GPX4對erastin誘導的H9C2細胞脂質過氧化和鐵死亡的影響

經erastin及轉染敲低GPX4的siRNA處理后，A、B、I、J組細胞死亡率及脂質ROS、MDA含量比較差異均有顯著意義(F=19.880～363.200，P<0.05)，其中J組與I組比較，上述3個指標均明顯升高(t=2.925～10.280,P<0.05)。見表1。

A～F分別為A～F組圖1 A～F組H9C2細胞的死亡情況

2.4 過表達NRF2對erastin誘導的H9C2細胞脂質過氧化和鐵死亡的影響

經erastin及轉染過表達NRF2質粒處理后，A、B、G、K組細胞死亡率及脂質ROS、MDA含量比較差異有顯著性(F=3.786～99.120，P<0.05)，其中K組與G組比較，上述3個指標均明顯降低(t=1.873～8.315,P<0.05)。見表1。

表1 A～K組H9C2細胞脂質過氧化和鐵死亡情況比較

2.5 Erastin及抑制劑Fer-1對H9C2細胞GPX4、NRF2 mRNA和蛋白相對表達水平的影響

經erastin及抑制劑Fer-1處理以后,A～C組H9C2細胞的GPX4、NRF2 mRNA和蛋白相對表達水平比較差異均具有顯著性(F=8.277～42.570，P<0.05)，其中C組與B組比較，上述指標均明顯升高(t=3.320～9.803,P<0.05)。見表2。

表2 A～C組H9C2細胞的GPX4、NRF2 mRNA和蛋白的相對表達水平比較

3 討 論

心血管疾病是最常見和最具危害的疾病之一，嚴重威脅著人類的生命健康。現在越來越多的研究證據表明，鐵代謝異常與心血管疾病密切相關。鐵蛋白重鏈(FTH)在鐵代謝和心臟疾病發病過程中中具有重要作用[15]。有研究證實，在特異性敲除心臟轉鐵蛋白受體(Tfr)基因的小鼠中，心臟缺鐵嚴重，最后致小鼠死亡[16]。在特異性敲除心臟ATP結合轉運蛋白(ABCB8)小鼠中，心肌細胞中出現鐵蓄積，并最終發展為心肌病[17]。由此可以推測，鐵缺乏和鐵超載與心血管系統疾病的發生發展密切相關[18]。但是，鐵參與心血管疾病的具體損傷機制目前仍不清楚，因此，該領域的研究將是未來心血管系統疾病治療的新方向。

鐵死亡是依賴于鐵的一種新的程序性細胞死亡方式。鐵死亡概念的提出，對解決鐵代謝與心血管系統疾病的關系，提供了新的思路。研究報道抑制鐵死亡可以減輕小鼠心臟缺血再灌注損傷[19]。鐵死亡抑制劑Fer-1可以顯著降低阿霉素導致的心肌毒性[20]。GPX4作為鐵死亡調控通路中的關鍵調節因子，使用GPX4特異性抑制劑RSL3抑制其活性，或者RNA干擾抑制內源性GPX4的表達，都會導致腫瘤細胞脂質ROS積累觸發鐵死亡[21]。本研究經鐵死亡抑制劑Fer-1處理H9C2細胞后，結果顯示細胞死亡率及脂質ROS、MDA含量明顯降低，表明Fer-1能夠抑制erastin誘導的H9C2細胞死亡。為了探究GPX4在erastin誘導的H9C2細胞鐵死亡中發揮的作用，本研究構建了GPX4過表達載體，將H9C2細胞經erastin及轉染GPX4過表達質粒處理后，結果顯示細胞死亡率以及脂質ROS、MDA含量均明顯降低，提示過表達GPX4可以抑制erastin誘導的H9C2細胞鐵死亡和脂質過氧化；同時本研究又構建了敲低GPX4的si-RNA， 在將H9C2細胞經erastin及si-GPX4處理后，結果顯示細胞死亡率及脂質ROS、MDA含量均明顯增高，提示抑制GPX4的內源性表達可以促進erastin誘導的H9C2細胞鐵死亡和脂質過氧化。以上結果表明GPX4在erastin誘導的H9C2細胞鐵死亡中發揮著保護作用。

NRF2是鐵死亡中重要的轉錄調控因子，在鐵、脂質和谷胱甘肽代謝中都發揮重要作用[22-24]。并且發現NRF2與阿爾茨海默病、呼吸系統疾病以及腫瘤等疾病也密切相關[14,22,25]。NRF2敲除的轉基因小鼠的心臟梗死面積增加，表明NRF2與心血管系統疾病的發病密切相關[26]。據文獻報道，GPX4是NRF2轉錄介導的基因，因此NRF2與GPX4存在靶向調控關系[14]，但是在心血管系統疾病中的作用還不是很清楚。為了進一步探究NRF2是否參與調控了GPX4的表達，本研究構建了NRF2的過表達的質粒，結果發現H9C2細胞經轉染NRF2過表達質粒處理后，GPX4的表達也增加。H9C2細胞經erastin及轉染過表達NRF2質粒處理后，細胞死亡率以及脂質ROS、MDA含量均明顯降低，提示NRF2可以抑制erastin誘導的H9C2細胞鐵死亡和脂質過氧化。為此推測NRF2對GPX4的調控是GPX4發揮保護作用的關鍵。

綜上所述，本研究通過對H9C2細胞經erastin以及GPX4、NRF2進行過表達處理后，發現GPX4和NRF2均參與了調控erastin誘導的H9C2細胞脂質過氧化和鐵死亡過程，NRF2可能是通過轉錄調控GPX4發揮作用的，本研究為心血管系統疾病鐵死亡的研究提供了更多的理論依據。